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Imunologia e Infecção

In Vivo infección con Leishmania amazonensis para evaluar la virulencia del parásito en ratones

Published: February 20, 2020
doi:
10.3791/60617
, , , ,
1Department of Physiology, Institute of Bioscience,University of Sao Paulo

Summary

Aquí, presentamos un protocolo compilado para evaluar la infección cutánea de ratones con Leishmania amazonensis. Este es un método confiable para estudiar la virulencia del parásito, permitiendo una visión sistémica de la respuesta del huésped vertebrado a la infección.

Abstract

Leishmania spp. son parásitos protozoarios que causan leishmaniasas, enfermedades que presentan un amplio espectro de manifestaciones clínicas desde lesiones cutáneas hasta lesiones viscerales. Actualmente, se estima que 12 millones de personas están infectadas con Leishmania en todo el mundo y más de 1.000 millones de personas viven a riesgo de infección. La leishmania amazonensis es endémica en América Central y del Sur y generalmente conduce a la forma cutánea de la enfermedad, que se puede visualizar directamente en un modelo animal. Por lo tanto, las cepas de L. amazonensis son buenos modelos para estudios de leishmaniasis cutánea porque también se cultivan fácilmente in vitro. Los ratones C57BL/6 imitan la progresión de la enfermedad impulsada por L. amazonensisobservada en humanos y son considerados uno de los mejores modelos de cepas de ratones para la leishmaniasis cutánea. En el huésped vertebrado, estos parásitos habitan macrófagos a pesar de los mecanismos de defensa de estas células. Varios estudios utilizan ensayos de infección por macrófagos in vitro para evaluar la infectividad del parásito en diferentes condiciones. Sin embargo, el enfoque in vitro se limita a un sistema celular aislado que no tiene en cuenta la respuesta del organismo. Aquí, compilamos un método de infección murino in vivo que proporciona una visión fisiológica sistémica de la interacción huésped-parásito. El protocolo detallado para la infección in vivo de ratones C57BL/6 con L. amazonensis comprende la diferenciación de parásitos en amastígolos infecciosos, la inoculación cutánea de la almohadilla de ratones, el desarrollo de lesiones y la determinación de la carga del parásito. Proponemos este método bien establecido como el método más adecuado para los estudios fisiológicos de las respuestas inmunitarias y metabólicas del huésped a la leishmaniasis cutánea.

Introduction

Las leishmaniases son enfermedades infecciosas parasitarias prevalentes en todo el mundo que representan importantes desafíos en los países en desarrollo y son reconocidas como una de las enfermedades tropicales desatendidas más importantes por la Organización Mundial de la Salud1,2. Las leishmaniasas se caracterizan por manifestaciones cutáneas, mucosas y/o viscerales. La leishmaniasis cutánea suele ser causada por L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica y L. aethiopica3. Esta forma de la enfermedad es a menudo la autorreparación en los seres humanos debido a la inducción de la respuesta inmune celular protectora. Sin embargo, la respuesta inmune celular puede fallar, y la enfermedad puede progresar a leishmaniasis cutánea diseminada4,5. No hay vacuna disponible debido a la diversidad entre las especies de Leishmania y a los antecedentes genéticos del huésped6,7. Las opciones de tratamiento también son limitadas, ya que la mayoría de los medicamentos disponibles actualmente son caros, tóxicos y/o pueden requerir tratamiento a largo plazo8,9. Además, ha habido informes de resistencia a los medicamentos contra los tratamientos disponibles10,11.

El agente causal de las leishmaniases es el parásito protozoario Leishmania. El parásito presenta dos formas morfológicas distintas en su ciclo de vida: los promastigotes, la forma flagelada que se encuentra en las moscas de arena; y amastigotes, la forma intracelular que se encuentra en las vacuolas parasitopóforas de los macrófagos huésped de mamíferos12,13. La capacidad de Amastigotes para invadir, sobrevivir y replicarse a pesar de los mecanismos de defensa de los macrófagos del huésped vertebrado están sujetos a muchos estudios14,15,16,17. En consecuencia, varios grupos de investigación han estado describiendo ensayos de infección por macrófagos in vitro para evaluar el impacto de factores ambientales específicos, así como genes parásitos y de acogida en la infectividad del parásito. Este ensayo presenta varias ventajas, como la capacidad de adaptar los estudios a un formato de alto rendimiento, un período de tiempo relativamente más corto para obtener resultados y un número reducido de animales de laboratorio sacrificados18. Sin embargo, los resultados de los ensayos in vitro son limitados porque no siempre replican los estudios in vivo14,19,20,21. Los ensayos in vivo proporcionan una visión fisiológica sistémica de la interacción huésped-parásito, que no puede ser completamente imitada por ensayos in vitro. Por ejemplo, los estudios inmunológicos se pueden realizar a través de ensayos inmunohistoquímicos de secciones de tejido de la almohadilla de pie recogidas o incluso de ganglios linfáticos popliteales para el análisis de las células inmunitarias recuperadas22.

Los animales se utilizan a menudo como modelo para las enfermedades humanas en la investigación biológica y biomédica para comprender mejor los mecanismos fisiológicos subyacentes de las enfermedades23. En el caso de la leishmaniasis, la ruta, el sitio o la dosis de inoculación influyen en el resultado de la enfermedad24,25,26,27. Además, la susceptibilidad y resistencia a la infección en humanos y ratones están altamente reguladas por los antecedentes genéticos del huésped y parásito4,5,22,28,29,30,31. Los ratones BALB/c son altamente susceptibles a la infección cutánea de L. amazonensis, mostrando una rápida progresión de la enfermedad con la diseminación de los parásitos a los ganglios linfáticos, el bazo y el hígado32. Como la enfermedad puede progresar a metástasis cutáneas, la infección puede ser mortal. Por el contrario, los ratones C57BL/6 a menudo desarrollan lesiones crónicas con cargas persistentes de parásitos en los ensayos de infección de L. amazonensis 33. Por lo tanto, la infección por L. amazonensis con esta especie de ratón en particular se ha considerado un excelente modelo para estudiar formas crónicas de leishmaniasis cutánea en humanos, ya que imita mejor la progresión de la enfermedad que la infección de ratones BALB/c modelo5,34.

Por lo tanto, proponemos que la infección murine in vivo es un método útil para los estudios fisiológicos de virulencia de Leishmania aplicables a la enfermedad humana, permitiendo una visión sistémica de la interacción huésped-parásito. Revisitando los ensayos bien establecidos22, presentamos aquí un protocolo paso a paso compilado de la infección in vivo de ratones C57BL/6 con L. amazonensis que comprende la diferenciación del parásito en amastigotes axensicos, inoculación cutánea de la almohadilla de ratones, desarrollo de lesiones y determinación de la carga del parásito. Este protocolo se puede adaptar a otras cepas de ratones y especies de Leishmania que causan leishmaniasis cutáneas. En conclusión, el método presentado aquí es crucial para identificar nuevas dianas y vacunasanti-Leishmania, así como en estudios fisiológicos de las respuestas inmunitarias y metabólicas del huésped a la infección por Leishmania.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Biociencia de la Universidad de Sao Paulo (CEUA 342/2019), y se llevaron a cabo de conformidad con las recomendaciones y políticas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Estado de Sao Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) y el gobierno brasileño (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Todos los pasos descritos en las secciones 1-5 deben llevarse a cabo asépticamente dentro de armarios d…

Representative Results

Los parásitos protozoos de leishmania existen en dos formas de desarrollo durante su ciclo de vida en huéspedes de invertebrados y vertebrados: promastigotes, las formas proliferativas que se encuentran en el lumen de la mosca de la arena femenina; y amastigotes, las formas proliferativas que se encuentran en las vacuolas parasitopóforas de las células huésped de los mamíferos. Los promastigotes tienen un cuerpo alargado de aproximadamente 1,5 m de ancho y 20 m de largo, co…

Discussion

El ensayo de infección in vivo descrito en este protocolo permite a cualquier investigador evaluar la leishmaniasis cutánea in vivo teniendo en cuenta la interacción huésped-parásito en un escenario sistémico. Estos ensayos han sido utilizados por muchos grupos22,24,27,29,31,32,34,<sup…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias a la Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Cámara del Centro Animal del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Sao Paulo por el apoyo y a la Dra. Silvia Reni Uliana por proporcionar la trituradora de tejido de vidrio. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación Sao Paulo (FAPESP – Beca MFLS’ 2017/23933-3).

Materials

96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension
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Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).
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