Detta protokoll möjliggör en tidsmatchat Beskrivning av bakterietillväxt under stressförhållanden vid encells-och cell populationsnivåerna.
Analys av bakteriernas förmåga att växa och överleva under stressförhållanden är avgörande för ett brett spektrum av mikrobiologiska studier. Det är relevant att karakterisera reaktionen av bakterieceller till stressinducerande behandlingar såsom exponering för antibiotika eller andra antimikrobiella föreningar, bestrålning, icke-Fysiologiskt pH, temperatur, eller salt koncentration. Olika stress behandlingar kan störa olika cellulära processer, inklusive celldelning, DNA-replikering, proteinsyntes, membran integritet, eller Cellcykelreglering. Dessa effekter är vanligtvis förknippade med specifika fenotyper på cell skalan. Därför kräver förståelse av omfattningen och orsakssamband av stressinducerad tillväxt eller livskraft brister en noggrann analys av flera parametrar, både på encellig och på populationsnivå. Den experimentella strategi som presenteras här kombinerar traditionell optisk densitet övervakning och plätering analyser med Single-cell analystekniker såsom flödescytometri och realtid mikroskopi Imaging i levande celler. Detta Multiscale ram möjliggör en tidslöst Beskrivning av effekterna av stress villkor på ödet för en bakterie population.
Det övergripande syftet med detta protokoll är att analysera beteendet hos bakterieceller som utsätts för stress behandlingar på befolkningen och på encellig nivå. Bakteriell tillväxt och lönsamhet är traditionellt behandlas på befolkningsnivå med hjälp av optisk densitet övervakning (OD600Nm), som är en proxy av bakteriell cell Mass syntes, eller genom plätering analyser för att bestämma koncentrationen av livskraftiga celler i kulturen (kolonin bildar enhet per milliliter, CFU/ml). Under normala (obetonade) odlingsförhållanden, är OD600Nm och CFU/ml mätningar strikt korrelerade eftersom bakteriell fördubblings tiden beror direkt på cellmassan öka1,2. Emellertid, detta samband är ofta störs under förhållanden som påverkar cellmassa syntes3, cell Division4, eller som utlöser cell Lys. Ett enkelt exempel ges av stress behandlingar som hämmar celldelning, vilket resulterar i bildandet av trådformiga bakterieceller5,6. Trådformiga celler elongate normalt eftersom cell Mass syntesen är opåverkad, men de är oförmögna att dela upp i livskraftiga celler. Den optiska kulturens densitet kommer följaktligen att öka med tiden i normal takt men inte koncentrationen av livskraftiga celler som bestäms av pläteringsanalyser (CFU/mL). I detta fall, som i många andra, optisk densitet och plätering mätningar är informativa men misslyckas med att ge en omfattande förståelse av den observerade stressinducerad effekt. Dessa Ensemble analyser måste kombineras med Single-cell analystekniker för att möjliggöra en djupgående karakterisering av stressinducerade tillväxt brister.
Här beskrivs ett förfarande som kombinerar fyra kompletterande experimentella metoder: (1) traditionella pläteringsanalyser och grundläggande optisk densitet övervakning för att övervaka cellernas lönsamhet och cell Mass syntes, respektive; (2) flödescytometri för att utvärdera Cellstorlek och DNA-innehållsparametrar på ett stort antal celler; (3) mikroskopi Snapshot Imaging för att analysera cellmorfologi; och (4) tidsförlopp Single-cell Imaging i mikroflödessystem kammare för undersökning av tidsmässiga dynamiken i cell öde. Detta multi-Scale Framework gör det möjligt att tolka de globala effekterna på celltillväxt och lönsamhet i ljuset av beteendet hos enskilda celler. Detta förfarande kan tillämpas för att dechiffrera svaret från olika bakteriearter till praktiskt taget alla stress av intresse, inklusive tillväxt under särskilda förhållanden (dvs., odlingssubstrat, pH, temperatur, salt koncentration), eller exponering för antibiotika eller andra antimikrobiella substanser.
Det är viktigt att uppmärksamma tillväxt tillståndet för cellerna under förfarandet. Odla cellerna över flera generationer innan de når en fullständig exponentiell fas. För framgången med denna metod är det viktigt att alla celler prover samlas samtidigt, och det är bäst att analysera endast en behandlad och en obehandlad kultur på samma gång. Cell prov för mikroskopi avbildning skall bibehållas vid försöks temperaturen under hela förfarandet. Det är då viktigt att förvärmas Mikroskop kammaren och mikroflödessystem kammare innan experimentet inleds. Om cellprover för flödescytometri inte kan analyseras lätt, kan de hållas på is i upp till 6 h. inkubation på is kommer att begränsa tillväxten och morfologisk modifiering av cellerna. Alternativt, användaren kan överväga att använda fixering av cellerna i etanol 75%, som vanligtvis rekommenderas för flödescytometri10. Om protokollet kräver tvättning av spännings induktor från mediet, Centrifugera och Pipettera celler mycket noggrant för att undvika att skada de potentiella avvikande cellerna.
Både flödescytometri och ögonblicks bilds analys ger tillgång till Cellstorlek och parametrar för DNA-innehåll, med ögonblicksbilder som ger ytterligare observation av cellmorfologin. DNA-färgning med DAPI10 (4 ‘, 6-diamidino-2-fenylindol) eller andra stabila DNA-färgämnen kan utföras om ingen fluorescerande fusion finns tillgänglig för att observera nukleoiderna i organismen av intresse. Om flödescytometrianalys inte kan utföras är det viktigt att avbilda och analysera ett stort antal celler med mikroskopi.
Mikroskopi avbildning kan också utföras med hjälp av stammar som transporterar fluorescerande fusioner till proteiner som är inblandade i specifika vägar av intresse. Detta skulle bidra till att avslöja effekten av stress på en mängd olika cellulära processer såsom replikering, transkription, cellväggsyntes, eller celldelning. Metoden kan appliceras på en rad bakteriearter, det enda kravet är att den mikrofluidiska apparaten skall vara förenlig med cellernas morfologi. Standard mikroflödessystem plattor är lämpliga för spö-form bakterier med en cellbredd mellan 0,7 μm och 4,5 μm. Kocker, ovokocker eller andra bakteriestammar med säregna former måste dock testas. Alternativt, om mikroflödessystem experiment inte kan utföras på grund av otillgänglighet av utrustningen eller oförenliga bakteriestammar, tid-lapse Imaging kan utföras på aganmonterade diabilder för en maximal tid på 2H.
Den övergripande fördelen med denna multi-Scale analys är att ge en global vision av effekten av stress induktion på flera aspekter av bakteriell tillväxtförmåga (dvs., Mass syntes, cell lönsamhet, cellmorfologi, membran integritet, DNA-innehåll) och hur dessa utvecklas med tiden i en bakterie population som växer under stressförhållanden. Det gör det också möjligt att analysera återställande av normal tillväxt på Single-cellnivå och populationsnivå. Metoden är tillämplig på ett brett spektrum av bakteriearter och praktiskt taget alla typer av stress behandling, såsom exponering för antibiotika eller andra antimikrobiella substanser, analys av påverkan av interaktion med andra organismer i flera arter populationer eller effekten av genetisk mutation.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar F. kornett för att ge Hupa-mCherry stam, a. Dedieu för tekniskt stöd med cytometry, och a. Ducret för hjälp med MicrobeJ. Finansiering: C. Lesterlin erkänner INSERM och CNRS institutioner samt ATIP-Avenir programmet, Schlumberger Stiftelsen för utbildning och forskning (FSER 2019), den ANR finansiering för PlasMed forskningsprogram (ANR-18-CE35-0008) samt FINOVI för finansiering till J. Cayron; La Ligue contre le cancer för finansiering av flödescytometerns utrustning. Författare bidrag: C.L. och J.C. konstruerade förfarandet och skrev papperet; J.C. utförde experimenten och analyserade data.
Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |