यह प्रोटोकॉल एकल कोशिका और सेल जनसंख्या के स्तर पर तनाव की स्थिति के तहत जीवाणु विकास के समय-समाधान विवरण की अनुमति देता है।
तनाव की स्थिति में बढ़ने और जीवित रहने की बैक्टीरियल क्षमता का विश्लेषण माइक्रोबायोलॉजी अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आवश्यक है। एंटीबायोटिक दवाओं या अन्य रोगाणुरोधी यौगिकों, विकिरण, गैर-शारीरिक पीएच, तापमान या नमक एकाग्रता के संपर्क में तनाव-उत्प्रेरण उपचार के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की विशेषता के लिए प्रासंगिक है। विभिन्न तनाव उपचार सेल डिवीजन, डीएनए प्रतिकृति, प्रोटीन संश्लेषण, झिल्ली अखंडता, या सेल चक्र विनियमन सहित विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं को परेशान कर सकते हैं। ये प्रभाव आमतौर पर सेलुलर पैमाने पर विशिष्ट फेनोटाइप से जुड़े होते हैं। इसलिए, तनाव से प्रेरित विकास या व्यवहार्यता कमियों की सीमा और करणीयता को समझने के लिए एकल कोशिका और जनसंख्या के स्तर दोनों पर कई मापदंडों का सावधानीपूर्वक विश्लेषण करने की आवश्यकता है । यहां प्रस्तुत प्रायोगिक रणनीति पारंपरिक ऑप्टिकल घनत्व निगरानी और चढ़ाना परखों को एकल सेल विश्लेषण तकनीकों जैसे प्रवाह साइटोमेट्री और लाइव कोशिकाओं में वास्तविक समय माइक्रोस्कोपी इमेजिंग को जोड़ती है। यह मल्टीस्केल फ्रेमवर्क बैक्टीरियल आबादी के भाग्य पर तनाव की स्थिति के प्रभाव का समय-समाधान विवरण देता है।
इस प्रोटोकॉल का समग्र उद्देश्य जनसंख्या पर और एकल-कोशिका स्तरों पर तनाव उपचार के संपर्क में आने वाले जीवाणु कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण करना है। बैक्टीरियल विकास और व्यवहार्यता पारंपरिक रूप से ऑप्टिकल घनत्व निगरानी (ओडी600एनएम)का उपयोग करके जनसंख्या स्तर पर संबोधित की जाती है, जो बैक्टीरियल सेल मास संश्लेषण का प्रॉक्सी है, या संस्कृति में व्यवहार्य कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए परख चढ़ाना (कॉलोनी बनाने इकाई प्रति मिलीलीटर, सीएफयू/एमएल)। सामान्य (अतनावपूर्ण) बढ़ती स्थितियों के तहत, ओडी600एनएम और सीएफयू/एमएल माप कड़ाई से सहसंबद्ध हैं क्योंकि बैक्टीरियल दोहरीकरण समय सीधे सेल मास वृद्धि1,2पर निर्भर करता है । हालांकि, यह सहसंबंध अक्सर उन स्थितियों के तहत बाधित होता है जो कोशिका द्रव्यमान संश्लेषण3,सेल डिवीजन4या ट्रिगर सेल लिसिस को प्रभावित करते हैं। तनाव उपचार द्वारा एक सरल उदाहरण प्रदान किया जाता है जो कोशिका विभाजन को रोकता है, जिसके परिणामस्वरूप फिलामेंतुस बैक्टीरियल कोशिकाओं का गठन5,6होता है। फिलामेंतुश कोशिकाएं सामान्य रूप से एकत्र होती हैं क्योंकि सेल मास संश्लेषण अप्रभावित होता है, लेकिन वे व्यवहार्य कोशिकाओं में विभाजित करने में असमर्थ होते हैं। संस्कृति ऑप्टिकल घनत्व फलस्वरूप एक सामान्य दर पर समय के साथ वृद्धि होगी, लेकिन नहीं व्यवहार्य परख (CFU/mL) चढ़ाना द्वारा निर्धारित कोशिकाओं की एकाग्रता । इस मामले में, कई अन्य लोगों की तरह, ऑप्टिकल घनत्व और चढ़ाना माप जानकारीपूर्ण हैं, लेकिन मनाया तनाव प्रेरित प्रभाव की एक व्यापक समझ प्रदान करने में विफल । इन पहनावा परखों को एकल-सेल विश्लेषण तकनीकों के साथ संयुक्त करने की आवश्यकता है ताकि तनाव-प्रेरित विकास की कमी के गहन लक्षण वर्णन की अनुमति दी जा सके ।
यहां, चार पूरक प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों को जोड़ती एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है: (1) पारंपरिक चढ़ाना परख और बुनियादी ऑप्टिकल घनत्व निगरानी सेल व्यवहार्यता और सेल मास संश्लेषण की निगरानी के लिए क्रमशः; (2) कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या पर कोशिका आकार और डीएनए सामग्री मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री; (3) सेल आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए माइक्रोस्कोपी स्नैपशॉट इमेजिंग; और (4) सेल भाग्य की लौकिक गतिशीलता की जांच के लिए माइक्रोफ्लूइडिक कक्षों में समय-चूक एकल सेल इमेजिंग। यह बहु-पैमाने पर ढांचा व्यक्तिगत कोशिकाओं के व्यवहार के आलोक में सेल विकास और व्यवहार्यता पर वैश्विक प्रभावों की व्याख्या करने की अनुमति देता है। इस प्रक्रिया को विशेष परिस्थितियों में वृद्धि (यानी, विकास माध्यम, पीएच, तापमान, नमक एकाग्रता), या एंटीबायोटिक दवाओं या अन्य के संपर्क में ब्याज के लगभग किसी भी तनाव के लिए विविध जीवाणु प्रजातियों की प्रतिक्रिया को समझने के लिए लागू किया जा सकता है रोगाणुरोधी यौगिक।
प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं की विकास स्थिति पर ध्यान देना आवश्यक है। एक पूर्ण घातीय चरण तक पहुंचने से पहले कई पीढ़ियों से अधिक कोशिकाओं को बढ़ाएं। इस विधि की सफलता के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सभी कोशिकाओं के नमूनों को एक साथ एकत्र किया जाता है, और एक ही समय में केवल एक इलाज और एक अनुपचारित संस्कृति का विश्लेषण करना सबसे अच्छा है। माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए सेल नमूनों को प्रक्रिया के दौरान प्रयोगात्मक तापमान पर बनाए रखा जाना चाहिए। इसके बाद प्रयोग की शुरुआत से पहले माइक्रोस्कोप चैंबर और माइक्रोफ्लूइडिक चैंबर को प्रीहीट करना जरूरी है । यदि प्रवाह साइटोमेट्री के लिए सेल नमूनों का आसानी से विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, तो उन्हें बर्फ पर 6 घंटे तक रखा जा सकता है। बर्फ पर ऊष्मायन कोशिकाओं के विकास और रूपात्मक संशोधन को सीमित करेगा। वैकल्पिक रूप से, उपयोगकर्ता इथेनॉल 75% में कोशिकाओं के निर्धारण का उपयोग करने पर विचार कर सकता है, जिसे आमतौर पर प्रवाह साइटोमेट्री10के लिए अनुशंसित किया जाता है। यदि प्रोटोकॉल के लिए संभावित गुमराह कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए मध्यम, अपकेंद्रित्र और पिपेट कोशिकाओं से तनाव प्रेरक धोने की आवश्यकता होती है।
दोनों प्रवाह साइटोमेट्री और स्नैपशॉट विश्लेषण सेल आकार और डीएनए सामग्री मापदंडों तक पहुंच देते हैं, स्नैपशॉट के साथ सेल आकृति विज्ञान का अतिरिक्त अवलोकन प्रदान करते हैं। DAPI10 (4′, 6-diamidino-2-phenylindole) या अन्य स्थिर डीएनए रंगों के साथ डीएनए धुंधला किया जा सकता है अगर कोई फ्लोरोसेंट संलयन ब्याज के जीव में नाभिक का पालन करने के लिए उपलब्ध है । यदि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, तो माइक्रोस्कोपी द्वारा बड़ी संख्या में कोशिकाओं की छवि और विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है।
माइक्रोस्कोपी इमेजिंग भी ब्याज के विशिष्ट रास्ते में शामिल प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंट संलयन ले जाने उपभेदों का उपयोग कर किया जा सकता है । इससे विभिन्न प्रकार की सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे प्रतिकृति, प्रतिलेखन, सेल वॉल संश्लेषण या सेल डिवीजन पर तनाव के प्रभाव को प्रकट करने में मदद मिलेगी। विधि को बैक्टीरियल प्रजातियों की एक श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है, केवल आवश्यकता यह है कि माइक्रोफ्लूइडिक उपकरण कोशिकाओं की आकृति विज्ञान के साथ संगत होना चाहिए। मानक माइक्रोफ्लूइडिक प्लेटें रॉड-आकार बैक्टीरिया के लिए सुविधाजनक हैं, जिनकी सेल चौड़ाई 0.7 माइक्रोन और 4.5 माइक्रोन के बीच होती है। हालांकि, विशिष्ट आकृतियों के साथ cocci, ovococci, या अन्य जीवाणु उपभेदों का परीक्षण करने की आवश्यकता है। वैकल्पिक रूप से, यदि उपकरण या असंगत बैक्टीरियल उपभेदों की अनुपलब्धता के कारण माइक्रोफ्लूइडिक प्रयोग नहीं किए जा सकते हैं, तो 2h की अधिकतम अवधि के लिए अगारोज-माउंटेड स्लाइड पर समय-चूक इमेजिंग की जा सकती है।
इस बहु-पैमाने पर विश्लेषण का समग्र लाभ बैक्टीरियल विकास क्षमता (यानी, बड़े पैमाने पर संश्लेषण, सेल व्यवहार्यता, कोशिका आकृति विज्ञान, झिल्ली अखंडता, डीएनए सामग्री) और जिस तरह से तनाव में शामिल होने के प्रभाव की वैश्विक दृष्टि प्रदान करना है। ये तनाव की स्थिति में बढ़ रही जीवाणु आबादी में समय के साथ विकसित होते हैं। यह एकल-कोशिका स्तर और जनसंख्या स्तर पर सामान्य विकास की बहाली का विश्लेषण करने की भी अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण जीवाणु प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला और लगभग किसी भी प्रकार के तनाव उपचार पर लागू होता है, जैसे एंटीबायोटिक या अन्य रोगाणुरोधी यौगिकों के संपर्क में, बहुप्रजातियों में अन्य जीवों के साथ बातचीत के प्रभाव का विश्लेषण आबादी, या आनुवंशिक उत्परिवर्तन का प्रभाव।
The authors have nothing to disclose.
लेखक ों ने साइटोमेट्री के साथ तकनीकी सहायता के लिए हुपा-एमचेरी स्ट्रेन, ए डेडियू और माइक्रोबेज के साथ मदद के लिए ए ड्यूक्रेट प्रदान करने के लिए एफ कॉर्नेट को धन्यवाद दिया। वित्तपोषण: सी लेस्टरलिन इंसेर्म और सीएनआरएस संस्थानों के साथ-साथ एटिप-एवेनिर कार्यक्रम, श्लमबर्ग फाउंडेशन फॉर एजुकेशन एंड रिसर्च (एफएसईआर 2019), प्लाज्मेड रिसर्च प्रोग्राम (एएनआर-18-CE35-0008) के साथ-साथ जे कैरॉन को फंडिंग के लिए फिनोवी के लिए एएनआर फंडिंग को स्वीकार करते हैं; फ्लो साइटोमीटर उपकरणों के वित्तपोषण के लिए ला लिग कॉन्ट्रे ले कैंसर। लेखक योगदान: सीएल और जेसी प्रक्रिया डिजाइन और कागज लिखा था; जेसी ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया और आंकड़ों का विश्लेषण किया ।
Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
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MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |