Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry
Summary
Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.
Abstract
İmmünohistokimya hem normal gelişimsel hem de hastalık durumlarında protein ekspresyonu ve lokalizasyonunu araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Birçok immünohistokimya protokolü memeli doku ve doku bölümleri için optimize edilmiş olsa da, bu protokoller genellikle memeli olmayan model organizmalar için modifikasyon ve optimizasyon gerektirir. Zebra balıkları, gelişim süreçlerinin moleküler, genetik ve hücresel biyolojik mekanizmalarını araştırmak için temel, biyomedikal ve çevirisel araştırmalarda giderek daha fazla model sistem olarak kullanılmaktadır. Zebra balığı bir model sistemi olarak birçok avantaj sunmak ama aynı zamanda optimal protein tespiti için modifiye teknikleri gerektirir. Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarda tam montaj floresan immünohistokimyası için protokolümüzü sağlıyoruz. Bu protokol ayrıca, istihdam edilebilen birkaç farklı montaj stratejisini ve her stratejinin sağladığı avantaj ve dezavantajlara genel bir bakışı açıklar. Ayrıca, tüm montaj dokusunda kromojenik substratların saptanmasını ve kesitli larva dokusunda floresan tespitine olanak sağlayacak değişiklikler de tanımlıyoruz. Bu protokol birçok gelişimevrelerinin ve embriyonik yapıların incelenmesi için geniş ölçüde geçerlidir.
Introduction
Zebra balığı(Danio rerio)kısa nesil zaman, hızlı gelişme ve genetik teknikler için amenability dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle biyolojik süreçlerin çalışması için güçlü bir model olarak ortaya çıkmıştır. Sonuç olarak, zebra balıkları genellikle toksikolojik araştırma ve ilaç keşif için yüksek iş ölçekli küçük molekül ekranlarda kullanılır. Zebra balığı aynı zamanda tek bir dişinin rutin olarak bir seferde 50-300 yumurta üretebildiği ve optik olarak berrak embriyoların gelişim süreçlerinin verimli bir şekilde görüntülenmesi için dışarıdan geliştiği göz önüne alındığında gelişimsel süreçlerin incelenmesi için de cazip bir modeldir. Ancak, erken araştırma n-etil-N-nitrozourea (ENU) veya diğer mutajenler ters genetik teknikler kurulmasında zorluklar nedeniyle kullanarak ileri genetik ekranlar çoğunlukla dayanıyordu. Kabaca yirmi yıl önce, morpholinos ilk zebra balığı nda hedeflenen genleri yıkmak için kullanılmıştır1. Morfolinonos erken gelişim aşamasında bir embriyo içine mikroenjeksiyon aşağıdaki hedef mRNA çeviri inhibe küçük antisense oligonükleotidler vardır. Morfolinoların en büyük zaafı, hücrelerin bölünmesiyle seyreltilmeleri ve genellikle döllenme sonrası (hpf) 72 saat etkisini kaybetmeleridir. Morpholos zebrabalığı gen bozulması için güçlü bir araç olmaya devam ederken, transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENs), çinko-parmak nükleazlar (ZFNs), ve düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) daha yakın zamanda doğrudan zebra balığıgenomu2,3hedef için kullanılmaktadır . Bu ters genetik stratejiler, ileri genetik ve yüksek iş elde ekranları ile birlikte, gen ekspresyonu ve fonksiyonu çalışma güçlü bir model olarak zebra balığı kurduk.
Gen fonksiyonunu inceleme yeteneği genellikle gen veya gen ürün ekspresyonunun spatio-temporal dağılımının değerlendirilmesi gerektirir. Erken gelişim sırasında bu tür ifade kalıplarını görselleştirmek için en sık kullanılan iki teknik yerinde hibridizasyon (ISH) ve tüm immünohistokimya (IHC) bulunmaktadır. In situ hibridizasyon ilk olarak 1969 yılında geliştirilmiştir ve birorganizmadamRNA ifadesini tespit etmek için etiketli antisense RNA problarının kullanımına dayanır 4 . Buna karşılık, etiketli antikorlar protein ekspresyonunu görselleştirmek için immünohistokimyada kullanılır. Algılama için proteinlerin etiketleme fikri 1930’ların5’ine kadar uzanır ve ilk IHC deneyi 1941’de FITC etiketli antikorların enfekte dokularda patojenik bakterileri tespit etmek için kullanıldığında yayınlanmıştır6. ISH ve IHC gelişti ve sonraki yıllarda önemli ölçüde geliştirilmiş ve şimdi her ikisi de rutin moleküler ve tanısal araştırma laboratuvarı7,8,9,10,11kullanılır . Her iki tekniğin de avantajları ve dezavantajları olsa da, IHC ISH üzerinde çeşitli avantajlar sunar. Pratik olarak, IHC ISH çok daha az zaman alıcı ve birincil antikor maliyetine bağlı olarak genellikle daha az pahalıdır. Buna ek olarak, mRNA ekspresyonu her zaman güvenilir bir protein ekspresyonu metomu değildir, çünkü farelerde ve insanlarda protein bolluğu varyasyonunun sadece üçte birinin mRNA bolluğu ile açıklanabileceği gösterilmiştir12. Bu nedenle, IHC ish verilerini onaylamak için önemli bir ektir, mümkün olduğunda. Son olarak, IHC ISH 13,14,15tarafından belirlenemeyen hücre altı ve eş yerelleştirme verileri sağlayabilir. Burada, zebra balığı embriyoları ve larvaları halinde immünohistokimya ile proteinleri güvenilir bir şekilde tespit etmek için adım adım bir yöntem tanımlıyoruz. Bu tekniğin amacı tüm embriyo ilgi bir proteinin mekansal ve zamansal ekspresyonu belirlemektir. Bu teknoloji antijene özgü primer antikorlar ve floresan etiketli ikincil antikorlar kullanır. Protokol, slayta monte edilmiş doku bölümlerinde ve floresan yerine kromojenik yüzeylerle kullanıma hazır dır. Bu protokolü kullanarak, biz zebra balığı iskelet kası gelişmekte olduğunu göstermek iyonotropik glutamat reseptörleri ifade eder, asetilkolin reseptörlerine ek olarak. NMDA tipi glutamat reseptör alt birimleri 23 hpf’de uzunlamasına kasüzerinde saptanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İmmünohistokimya bir organizmada ilgi hemen hemen herhangi bir protein in spatio-temporal ifade karakterize etmek için kullanılabilecek çok yönlü bir araçtır. İmmünohistokimya dokular ve model organizmaların geniş bir yelpazede kullanılır. Bu protokol zebra balıklarında kullanılmak üzere optimize edilmiştir. Farklı türlerde immünohistokimya farklı fiksasyon ve işleme teknikleri, türlere ve endojen peroksidazların varlığına bağlı olarak çözümler engelleme ve dokuların kalınlığı ve b…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH hibe 8P20GM103436 14 fon.
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
Referências
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neurociência. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all–a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
