Зебрафиш(Danio rerio) стала мощной моделью для изучения биологических процессов по нескольким причинам, включая короткое время генерации, быстрое развитие и удобство генетических методов. В результате, зебрафиш обычно используются в высокой пропускной связи малых молекул экранов для токсикологических исследований и открытия наркотиков. Зебрафиш также является привлекательной моделью для изучения процессов развития, учитывая, что одна женщина может регулярно производить 50-300 яиц за один раз, а оптически прозрачные эмбрионы развиваются внешне, что позволяет эффективно визуализировать процессы развития. Тем не менее, ранние исследования опирались главным образом на передние генетические экраны с использованием N-этил-N-нитросуреа (ENU) или других мутагенов из-за проблем в создании обратных генетических методов. Примерно два десятилетия назад, морфолинос были впервые использованы в зебрафиш для нокдауна целевых генов¹. Morpholinos являются небольшие антисмысловые олигонуклеотиды, которые препятствуют переводу целевой мРНК после микроинъекции в эмбрион на ранней стадии развития. Основным недостатком морфинос является то, что они разбавляются по мере деления клеток и, как правило, теряют эффективность на 72 часа после оплодотворения (hpf). В то время как морфолиносы остаются мощным инструментом для нарушения гена зебры, транскрипционный активатор- эффектоподобный эффект (TALENs), нуклизы цинка-пальца (ЗФН) и кластерные регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPRs) в последнее время используются для непосредственной цели генома зебры^2,3. Эти обратные генетические стратегии, в сочетании с вперед генетики и высокой пропускной технологии экраны, создали зебры в качестве мощной модели для изучения экспрессии генов и функции.

Способность изучать функцию генов обычно требует оценки пространственно-временного распределения экспрессии генов или генных продуктов. Два наиболее часто используемых методов визуализации таких моделей выражения в начале разработки на месте гибридизации (ISH) и целом горе иммуногистохимии (IHC). На месте гибридизация была впервые разработана в 1969 году и опирается на использование помеченных антисмысловых зондов РНК для обнаружения экспрессии мРНК в организме⁴. В отличие от этого, помеченные антитела используются в иммуногистохимии для визуализации экспрессии белка. Идея маркировки белков для обнаружения восходит к⁵ 1930-х годов и первый эксперимент IHC был опубликован в 1941 году, когда FITC помечены антитела были использованы для обнаружения патогенных бактерий в инфицированных тканях⁶. ISH и IHC значительно эволюционировали и значительно улучшились в течение последующих десятилетий и в настоящее время оба регулярно используются в молекулярно-диагностической исследовательской лаборатории^7,8,9,10,11. Хотя оба метода имеют преимущества и недостатки, IHC предлагает ряд преимуществ по сравнению с ISH. Практически, IHC гораздо меньше времени, чем ISH и, как правило, дешевле в зависимости от стоимости первичного антитела. Кроме того, выражение мРНК не всегда является надежным показателем экспрессии белка, как было продемонстрировано у мышей и людей, что только около трети вариации изобилия белка можно объяснить изобилием мРНК^12. По этой причине, IHC является важным дополнением для подтверждения данных ISH, когда это возможно. Наконец, IHC может предоставить данные субклеточной и совместной локализации, которые не могут быть определены ISH^13,14,15. Здесь мы описываем пошаговый метод надежного обнаружения белков иммуногистохимией в целых эмбрионах зебры и личинках. Целью данной методики является определение пространственного и временного выражения белка, интересуемого во всем эмбрионе. Эта технология использует антиген-специфические первичные антитела и флуоресцентно помеченные вторичные антитела. Протокол легко адаптируется к использованию на слайд-установленных секциях тканей и для использования с хромогенными субстратами вместо флуоресценции. Используя этот протокол, мы демонстрируем, что развитие скелетных мышц зебры выражает ионотропные рецепторы глутамата, в дополнение к рецепторам ацетилхолина. NMDA-типа глутаматных рецепторов субъединиц обнаруживаются на продольной мышцы на 23 л.с.