제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학
Summary
여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레의 전체 준비에 있는 단백질의 형광 항체 중재한 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
면역 조직 화학은 일반적인 발달 및 질병 상태 둘 다 도중 단백질 발현 그리고 현지화를 탐구하기 위하여 널리 이용되는 기술입니다. 많은 면역 조직 화학 프로토콜이 포유류 조직 및 조직 섹션에 최적화되었지만, 이러한 프로토콜은 종종 비 포유류 모델 유기체에 대한 수정 및 최적화가 필요합니다. Zebrafish는 발달 과정의 분자, 유전 및 세포 생물학적 메커니즘을 조사하기 위해 기본, 생물 의학 및 번역 연구에서 모델 시스템으로 점점 더 많이 사용되고 있습니다. Zebrafish는 모델 시스템으로서 많은 이점을 제공하지만 최적의 단백질 검출을 위해 수정된 기술이 필요합니다. 여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레에 있는 전체 마운트 형광 면역성 화학을 위한 우리의 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 사용할 수 있는 여러 가지 장착 전략과 각 전략이 제공하는 장점과 단점에 대한 개요를 설명합니다. 우리는 또한 단면된 애벌레 조직에서 전체 마운트 조직 및 형광 검출에 있는 발색성 기단의 검출을 허용하기 위하여 이 프로토콜에 수정을 기술합니다. 이 프로토콜은 많은 발달 단계 및 배아 구조의 연구에 광범위하게 적용 가능하다.
Introduction
제브라피쉬(Daniorerio)는짧은 생성 시간, 급속한 발달 및 유전 기술의 어메니티를 포함한 여러 가지 이유로 생물학적 과정의 연구를 위한 강력한 모델로 부상했습니다. 그 결과, 제브라피쉬는 독성 연구 및 약물 발견을 위해 처리량이 높은 소분자 스크린에 일반적으로 사용됩니다. Zebrafish는 한 번에 50-300 개의 알을 일상적으로 생산할 수 있고 광학적으로 명확한 배아가 외부에서 개발되어 개발 과정의 효율적인 시각화를 허용하는 것을 감안할 때 개발 프로세스 연구를위한 매력적인 모델입니다. 그러나, 초기 연구는 역유전 기술을 확립하는 도전 때문에 N-ethyl-N-n-n-nitrosourea (ENU) 또는 그밖 돌연변이원을 사용하여 앞으로 유전 스크린에 주로 의존했습니다. 대략 2십년 전, morpholinos는 표적으로 한 유전자를 녹다운하기 위하여 zebrafish에서 처음으로 이용되었습니다1. 모르폴리노는 초기 발달 단계에서 배아로 미세 주입 다음 표적 mRNA의 번역을 억제하는 작은 안티센스 올리고뉴클레오티드입니다. morpholinos의 주요 약점은 세포가 분열하고 일반적으로 72 시간 후 수정 (hpf)에 의해 효과를 잃을 때 희석된다는 것입니다. 모르폴리노는 제브라피시 유전자 파괴를 위한 강력한 도구로 남아 있지만, 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴클레아제(TALENs), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFNs), 클러스터된 정기적으로 간격이 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPRs)이 최근에는 제브라피시 게놈2,3을직접 표적으로 하는 데 사용되고 있다. 이러한 역유전적 전략은 전방 유전학 및 높은 처리량 스크린과 함께 유전자 발현 및 기능을 연구하는 강력한 모델로 zebrafish를 확립했습니다.
유전자 기능을 연구하는 능력은 일반적으로 유전자 또는 유전자 생성물 발현의 시간적 분포에 대한 평가를 필요로 한다. 초기 발달 도중 그 같은 발현 패턴을 구상하기 위하여 일반적으로 이용되는 2개의 기술은 기업 혼성화 (ISH) 및 전체 마운트 면역성 화학 (IHC)에서 입니다. situ 혼성화는 1969년에 처음 개발되었고 유기체4에서mRNA 발현을 검출하기 위해 표지된 안티센스 RNA 프로브의 사용에 의존한다. 대조적으로, 표지된 항체는 단백질 발현을 구상하기 위하여 면역성 화학에서 이용됩니다. 검출을 위한 단백질 표지의 아이디어는 1930년대5로 거슬러 올라가고 첫번째 IHC 실험은 FITC 표지된 항체가 감염한 조직에 있는 병원성 박테리아를 검출하기 위하여 이용될 때 1941년에 간행되었습니다6. ISH와 IHC는 이후 수십 년 동안 크게 진화하고 개선되었으며 현재 분자 및 진단 연구 실험실7,8,9,10,11에서일상적으로 사용됩니다. 두 기술 모두 장점과 단점이 있지만 IHC는 ISH에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 실질적으로, IHC는 ISH보다 훨씬 적은 시간이 소요되며 일반적으로 1차 항체의 비용에 따라 저렴하다. 또한, mRNA 발현은 항상 단백질 풍부도의 약 3분의 1만이 mRNA풍부도 12에의해 설명될 수 있다는 것을 마우스 및 인간에서 입증된 바와 같이 단백질 발현의 신뢰할 수 있는 메트릭이 아니다. 이러한 이유로 IHC는 가능한 경우 ISH 데이터를 확인하는 중요한 보충 자료입니다. 마지막으로, IHC는 ISH13,14및15로결정할 수 없는 세포내 및 공동 지역화 데이터를 제공할 수 있습니다. 여기서, 우리는 제브라피시 배아 및 유충 전체에서 면역조직화학에 의해 단백질을 안정적으로 검출하는 단계별 방법을 설명한다. 이 기술의 목적은 전체 배아에서 관심 있는 단백질의 공간적 및 시간적 발현을 결정하는 것이다. 이 기술은 항원 특이적 1 차 항체 및 형광 태그이 붙은 이차 항체를 이용합니다. 이 프로토콜은 슬라이드 장착 조직 섹션에 사용하고 형광 대신 발색 기질과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 제브라피시 골격 근을 개발하는 것은 아세틸 콜린 수용체 이외에, ionotropic 글루타메이트 수용체를 표현한다는 것을 보여줍니다. NMDA 형 글루타메이트 수용체 소단위는 23 hpf에서 세로 근육에서 검출할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
면역화학은 유기체에 관심 있는 거의 모든 단백질의 주공간적 발현을 특성화하는 데 사용할 수 있는 다목적 도구이다. 면역 조직 화학은 다양한 조직 및 모델 유기체에 사용됩니다. 이 프로토콜은 제브라피시에 사용하도록 최적화되었습니다. 상이한 종의 면역조직화학은 조직의 두께 및 조성으로 인한 종 및 내인성 과산화증의 존재에 따라 다른 고정 및 취급 기술, 차단 용액을 필요로 할 수 있습…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH 보조금 8P20GM103436 14.
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
Referências
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