Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle puissant pour l’étude des processus biologiques pour plusieurs raisons, y compris le temps de génération court, le développement rapide, et l’agréabilité aux techniques génétiques. En conséquence, le poisson zèbre est couramment utilisé dans les écrans à haut débit de petites molécules pour la recherche toxicologique et la découverte de médicaments. Le poisson zèbre est également un modèle attrayant pour l’étude des processus de développement étant donné qu’une seule femelle peut régulièrement produire 50-300 œufs à la fois et les embryons optiquement clairs se développent à l’extérieur permettant une visualisation efficace des processus de développement. Cependant, les premières recherches se sont surtout appuyées sur des écrans génétiques avancés utilisant n-éthyle-N-nitrosourea (ENU) ou d’autres mutagènes en raison de difficultés à établir des techniques génétiques inversées. Il y a environ deux décennies, les morpholinos ont été utilisés pour la première fois chez le poisson zèbre pour éliminer les gènes ciblés¹. Les morpholinos sont de petits oligonucléotides antisens qui inhibent la traduction de l’ARNm cible après la microinjection dans un embryon à un stade de développement précoce. Une faiblesse majeure des morpholinos est qu’ils sont dilués pendant que les cellules se divisent et perdent généralement l’efficacité par 72 heures après la fertilisation (hpf). Tandis que les morpholinos restent un outil puissant pour la perturbation de gène de poisson-zèbre, les nucléases d’effecteur de transcription-comme d’activateur (TALENs), les nucléases de zinc-doigt (ZFNs), et les groupés régulièrement interspaced courtes répétitions palindromic (CRISPRs) sont plus récemment employés pour cibler directement le génome de poisson zèbre^2,3. Ces stratégies génétiques inversées, combinées à la génétique avancée et aux écrans à haut débit, ont établi le poisson zèbre comme un modèle puissant pour étudier l’expression et la fonction des gènes.

La capacité d’étudier la fonction de gène exige généralement une évaluation de la distribution spatio-temporelle de l’expression de gène ou de produit de gène. Les deux techniques les plus couramment utilisées pour visualiser de tels modèles d’expression au début du développement sont l’hybridation in situ (ISH) et l’immunohistochimie de montage entier (IHC). L’hybridation in situ a été développée pour la première fois en 1969 et repose sur l’utilisation de sondes d’ARN antisens étiquetées pour détecter l’expression de l’ARNm dans un organisme⁴. En revanche, les anticorps étiquetés sont utilisés dans l’immunohistochimie pour visualiser l’expression des protéines. L’idée d’étiqueter les protéines pour la détection remonte aux^années 5 des années 1930 et la première expérience du CIH a été publiée en 1941 lorsque des anticorps étiquetés FITC ont été utilisés pour détecter les bactéries pathogènes dans les tissus infectés⁶. ISH et IHC ont évolué et amélioré de manière significative au cours des décennies suivantes et sont maintenant à la fois couramment utilisés dans le laboratoire de recherche moléculaire et diagnostique^7,8,9,10^,11. Bien que les deux techniques présentent des avantages et des inconvénients, le CSI offre plusieurs avantages par rapport à l’ISH. Pratiquement, le CSI prend beaucoup moins de temps qu’ISH et est généralement moins coûteux en fonction du coût de l’anticorps primaire. En outre, l’expression de l’ARNm n’est pas toujours une mesure fiable de l’expression des protéines, car il a été démontré chez les souris et les humains que seulement environ un tiers de la variation de l’abondance des protéines peut être expliquée par l’abondance de l’ARNm¹². Pour cette raison, IHC est un supplément important pour confirmer les données ISH, si possible. Enfin, le CSI peut fournir des données subcellulaires et de co-localisation qui ne peuvent pas être déterminées par ISH^13,14,15. Ici, nous décrivons une méthode étape par étape pour détecter de façon fiable des protéines par immunohistochimie dans les embryons et les larves de poissons zèbres de monture entière. Le but de cette technique est de déterminer l’expression spatiale et temporelle d’une protéine d’intérêt dans l’embryon entier. Cette technologie utilise des anticorps primaires spécifiques à l’antigène et des anticorps secondaires étiquetés fluorescents. Le protocole est facilement adaptable pour une utilisation sur les sections de tissu montés sur la diapositive et pour une utilisation avec des substrats chromogéniques au lieu de la fluorescence. Utilisant ce protocole, nous démontrons que le développement du muscle squelettique de poisson zèbre exprime des récepteurs ionotropic de glutamate, en plus des récepteurs d’acétylcholine. Les sous-unités de récepteur de glutamate de type NMDA sont détectables sur le muscle longitudinal à 23 hpf.