Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie
Summary
Het doel van dit protocol is om twee verschillende celtypen te fuseren om hybride cellen te maken. Fluorescentiemicroscopie analyse van gesmolten cellen wordt gebruikt om de cel van oorsprong van cellulaire organellen te volgen. Deze test kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe cellulaire structuur en functie reageren op perturbatie door celfusie.
Abstract
Het leven is ruimtelijk gepartitioneerd binnen lipide membranen om de geïsoleerde vorming van verschillende moleculaire toestanden binnen cellen en organellen mogelijk te maken. Celfusie is de fusie van twee of meer cellen om een enkele cel te vormen. Hier bieden we een protocol voor celfusie van twee verschillende celtypen. Gesmolten hybride cellen worden verrijkt door flow cytometrie-gebaseerde sortering, gevolgd door fluorescentiemicroscopie van hybride celstructuur en-functie. Fluorescerend gelabelde eiwitten gegenereerd door genoom bewerking worden in gesmolten cellen afgebeeld, waardoor cellulaire structuren kunnen worden geïdentificeerd op basis van fluorescentie emissie en waarnaar wordt verwezen terug naar het celtype van oorsprong. Deze robuuste en algemene methode kan worden toegepast op verschillende celtypen of organellen van belang, om de cellulaire structuur en functie over een scala van fundamentele biologische vragen te begrijpen.
Introduction
Homeostatisch onderhoud van cellulaire structuur is essentieel voor het leven. Cellen hebben karakteristieke morfologieën, sub-cellulaire organel getallen, en interne biochemische samenstelling. Inzicht in hoe deze fundamentele eigenschappen worden gegenereerd en hoe ze gaan mis tijdens de ziekte vereist laboratorium gereedschap om hen te perturb.
Celfusie is het samenvoegen van twee of meer afzonderlijke cellen. Celfusie kan cruciaal zijn geweest voor de opkomst van eukaryotische leven1. In het menselijk lichaam is celfusie relatief zeldzaam, die optreedt tijdens beperkte ontwikkelingsomstandigheden en weefsel typen, zoals tijdens de bevruchting of de vorming van spieren, botten en de placenta2. Dit protocol beschrijft de inductie van celcelfusie in weefselkweek cellijnen met differentieel fluorescently gelabelde organellen, als een instrument om de mechanismen te begrijpen die de celstructuur en-functie beheersen.
In vitro geïnduceerde celcelfusie staat centraal in de productie van monoklonale antilichamen3, een belangrijk hulpmiddel voor biologisch onderzoek en ziekte behandeling. Cell Fusion is ook gebruikt om te vragen veel verschillende fundamentele cel biologische vragen over celcyclus dominantie4, aneuploïdie5,6, cellulaire herprogrammering7,8, de reparatie van beschadigde neuronen9, virale proliferatie10, apoptosis11, tumorvorming12, cytoskelet Dynamics13, en membraan fusie14,15. Laboratorium gebaseerde methoden voor het opwekken van celcelfusie16,17,18,19 induceren lipide membraan coalescentie door de fysieke samenvoeging van twee bilayers in één. Celfusie kan worden geïnduceerd door elektriciteit18, virale gebaseerdemethoden 17, thermsmonic verwarming20, transgen expressie19, en chemicaliën met inbegrip van polyethyleenglycol (PEG)16,21,22.
Centrosomes zijn microtubulus organiserende centra die cellulaire vorm, beweeglijkheid, polarisatie en divisie23beheersen. Centrosomale wortels zijn vezelachtige structuren die zich uitstrekken van nucleotiderende met het eiwit rootletin24 (gecodeerd door het gen crocc). We hebben onlangs gebruikt cel-cel fusie om te begrijpen hoe centrosoom positie en het aantal varieert binnen heterokaryons ten opzichte van ouderlijke cellen24. De beweegreden achter het gebruik van deze methode is om de cel van oorsprong van wortels binnen een heterokaryon te volgen na fusie van differentieel fluorescendig gelabelde ouderlijke cellen, en dus voorbeeld organel fusie en splijting. De fluorescently gelabelde eiwitten rootletin-meGFP of rootletin-mScarlet-ik zijn gemaakt door genoom Editing in afzonderlijke cellijnen die vervolgens worden gesmolten door PEG-gemedieerde celfusie. We beschrijven het gebruik van celkleurstoffen (tabel met materialen) om gesmolten cellen te identificeren door Flowcytometrie en daaropvolgende fluorescentiemicroscopie-identificatie van centroeen cel van oorsprong en morfologie (Figuur 1). Deze aanpak is een robuuste en unieke methode om te bestuderen hoe belangrijke veranderingen in cellulaire toestand, met inbegrip van organel nummer afbreuk aan op cel homeostase.
Protocol
Representative Results
Discussion
We demonstreren een faciele en kosteneffectieve protocol voor het fusing cellen en visualiseren van de daaropvolgende architectuur van celhybriden met microscopie, het nemen van ongeveer twee dagen van start tot finish. Kritieke delen van dit protocol zijn de verrijking van gesmolten cellen door celsortering (protocol sectie 3), en zorgvuldige validatie van gesmolten cellen door microscopie (protocol sectie 4). Deze secties zorgen ervoor dat gesmolten cellen gemakkelijk worden verkregen en bonafide heterokaryonen zijn. C…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship naar R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant Number 100090/12/Z). De Funder had geen rol in het studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript. We danken Ashok Venkitaraman en Paul French voor kritisch advies en begeleiding bij het project. We danken Chiara Cossetti en Gabriela Grondys-Kotarba in het Cambridge Institute for Medical Research flow Cytometry faciliteit voor uitstekende ondersteuning. We danken Liam Cassiday, Thomas Miller, en Gianmarco Contino voor het naleden van het manuscript.
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
Referências
- Lane, N. . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?. Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich’s ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
