चूहों में इन्फ्लूएंजा ए वायरस संक्रमण के दौरान टी कूप सहायक कोशिकाओं और अंकुरित केंद्र प्रतिक्रिया का मूल्यांकन
Summary
यह पेपर इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण के माउस मॉडल में टीएफएच और जीसी बी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
Abstract
टी कूप सहायक (Tfh) कोशिकाओं एक स्वतंत्र CD4+ टी सेल सबसेट अंकुरित केंद्र (जीसी) विकास और उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए मदद प्रदान करने में विशेषज्ञता है । इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण में, प्रभावी वायरस उन्मूलन की सुविधा के लिए मजबूत टीएफएच और जीसी बी सेल प्रतिक्रियाएं प्रेरित होती हैं, जो टीएफएच से जुड़े अध्ययन के लिए एक योग्य माउस मॉडल प्रदान करती हैं। इस पेपर में हमने चूहों में इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण के दौरान बेसिक टीएफएच से जुड़ी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का पता लगाने में प्रोटोकॉल का वर्णन किया । इन प्रोटोकॉल में शामिल हैं: इन्फ्लूएंजा वायरस का इंट्रानासल टीका; पॉलीक्लोनल और एंटीजन-विशिष्ट टीएफएच कोशिकाओं, जीसी बी कोशिकाओं और प्लाज्मा कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला और विश्लेषण; जीसी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन; सीरम में इन्फ्लूएंजा वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी के एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) । ये परख मूल रूप से इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण में टीएफएच कोशिकाओं के भेदभाव और कार्य की मात्रा निर्धारित करते हैं, इस प्रकार भेदभाव तंत्र और हेरफेर रणनीति को स्पष्ट करने में अध्ययन के लिए मदद प्रदान करते हैं।
Introduction
हाल के दशक में, कई अध्ययनों को अंकुरित केंद्र (जीसी) बी विकास में अपनी आवश्यक भूमिकाओं के लिए नए पहचाने गए सीडी 4+ टी सेल सबसेट, टीएफएच सेल सबसेट पर केंद्रित किया गया है। बी सेल लिंफोमा 6 (बीसीएल6), जिसे मुख्य रूप से जीन दमनकारी माना जाता है, इस साक्ष्य के लिए टीएफएच कोशिकाओं का वंश-परिभाषित कारक है कि बीसीएल 6 की एक्टोपिक अभिव्यक्ति टीएफएच भेदभाव को चलाने के लिए पर्याप्त है, जबकि बीसीएल6 के परिणाम की कमी गायब हो गई टीएफएच विभेदन1,2,3। अन्य सीडी 4+ टी सहायक सबसेट सूजन की साइटों पर माइग्रेशन द्वारा अपने प्रभावक कार्य करने के विपरीत, टीएफएच कोशिकाएं मुख्य रूप से तिल्ली और लिम्फ नोड के बी सेल कूप क्षेत्र में बी सेल सहायता प्रदान करती हैं। सह-उत्तेजक अणु आईसीओएस और सीडी 40एल, टीएफएच और जीसी बी कोशिकाओं के बीच बातचीत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। टीएफएच भेदभाव के दौरान, आईसीओ कॉग्नेट बी कोशिकाओं से आवश्यक संकेतों को प्रसारित करता है और बी सेल जोन स्थानीयकरण4,5के लिए दर्शक बी कोशिकाओं से माइग्रेशन सिग्नल प्राप्त करने वाले रिसेप्टर के रूप में भी कार्य करता है। CD40L बी कोशिकाओं के प्रसार और अस्तित्व6के लिए टीएफएच कोशिकाओं से संकेतों का एक मध्यस्थ है । CD40L के समान भूमिका निभाने वाला एक अन्य कारक साइटोकिन आईएल21 है, जो मुख्य रूप से टीएफएच कोशिकाओं द्वारा स्रावित किया जाता है। IL21 सीधे जीसी बी कोशिकाओं के विकास और उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी के उत्पादन को नियंत्रित करता है, लेकिन Tfh भेदभाव में अपनी भूमिका अभी भी विवादास्पद7,8है । पीडी-1 और सीएक्ससीआर 5, जो अब प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में टीएफएच कोशिकाओं की पहचान करने में सबसे अधिक उपयोग किए जाते हैं, इस सबसेट के विभेदन और कार्य में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। CXCR5 बी सेल कूप केमोकिन का रिसेप्टर है और बी सेल कूप9में टीएफएच कोशिकाओं के स्थानीयकरण में मध्यस्थता करता है। पीडी-1 की पहचान अब न केवल कूप मार्गदर्शन समारोह के लिए की गई है बल्कि जीसी बी कोशिकाओं आत्मीयता परिपक्वता10की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण संकेतों को भी प्रसारित करती है । इन निष्कर्षों के आधार पर, इन अणुओं की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन मूल रूप से टीएफएच कोशिकाओं की परिपक्वता और कार्य को प्रतिबिंबित कर सकता है।
जीसी माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में एक प्रेरित क्षणिक माइक्रोएनाटॉमिकल संरचना है और टीएफएच कोशिकाओं पर अत्यधिक निर्भर है, इस प्रकार टीएफएच प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श रीडआउट है। जीसी में, साइटोकिन्स और सह-उत्तेजक अणुओं द्वारा मध्यस्थता किए गए संकेतों को प्राप्त करने के बाद, बी कोशिकाएं उच्च-आत्मीयता एंटीबॉडी11उत्पन्न करने के लिए वर्ग स्विचिंग और दैहिक हाइपरम्यूटेशन के अधीन हैं। अंतर एंटीबॉडी वर्ग स्विचिंग अंतर साइटोकिन आला में होता है, जिसमें आईएल4 और आईएल21 आईजीजी 1 वर्ग स्विचिंग को प्रेरित करते हैं जबकि IFNγ आईजीजी 2 वर्ग स्विचिंग12को प्रेरित करता है। प्लाज्मा कोशिकाएं गुप्त एंटीबॉडी के उत्पादक हैं और मरणासन्न विभेदित कोशिकाएं हैं। टीएफएच कोशिकाओं की तरह, जीसी में बी कोशिकाओं का विकास कई महत्वपूर्ण अणुओं की गतिशील अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ है। वर्तमान अध्ययन के आधार पर, जीसी बी कोशिकाओं को B220 + PNA+Fas+ या B220+GL7+Fas +कोशिकाओं और प्लाज्मा कोशिकाओं के रूप में पहचाना जा सकता है, उनके अग्रदूतों की तुलना में, B220 की अभिव्यक्ति को कम करना और CD138 अभिव्यक्ति13को बढ़ाया जा सकता है । क्या अधिक है, इन दोनों विशेषताओं प्रवाह साइटोमेट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण में पता लगाया जा सकता है, इस प्रकार जीसी प्रतिक्रिया का उचित मूल्यांकन किया जा रहा है ।
मजबूत सेलुलर और विनोदी प्रतिक्रियाएं इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण में प्रेरित होती हैं, टीएफएच और टीएच1 कोशिकाओं पर हावी होने वाली सीडी 4+ टी सेल रिस्पांस14,जो इसे टीएफएच कोशिकाओं के भेदभाव अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल बनाती है। इन्फ्लूएंजा ए/प्यूर्टो रिको/8/34 एच1एन1 (पीआर8), जो आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला माउस-अनुकूलित तनाव है, अक्सर इस अध्ययन में14,15,16का उपयोग किया जाता है । यहां, हम टीएफएच अध्ययन के कुछ बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं-इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण में प्रासंगिक परख: 1) पीआर 8 वायरस का इंट्रानासल टीका; 2) एंटीजन-विशिष्ट टीएफएच कोशिकाएं, जीसी बी और प्लाज्मा कोशिकाएं और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ आईएल21 का पता लगाना; 3) जीसी के हिस्टोलॉजिकल विज़ुअलाइज़ेशन; 4) एलिसा के साथ सीरम में एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी टाइटर का पता लगाना। ये प्रोटोकॉल टीएफएच से जुड़े अध्ययन में नए शोधकर्ताओं के लिए आवश्यक तकनीक प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी पैदा करने के लिए बी-सेल मदद प्रदान करने में विशेष भूमिकाओं के कारण, टीके डिजाइन के लिए नई रणनीतियों को प्रदान करने के लिए भेदभाव और हेरफेर के तंत्र में टीएफएच कोशिकाओं का बड़े पै?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनकी तकनीकी मदद और सलाह के लिए शंघाई के इंस्टीटयूट पाश्चर के फ्लो साइटोमेट्री फैसिलिटी, एबीएसएल2 फैसिलिटी और एसपीएफ एनिमल फैसिलिटी के कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं । इस काम को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: चीनी विज्ञान अकादमी (XDB29030103), चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016YFA0502202), नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (31570886) का रणनीतिक प्राथमिकता अनुसंधान कार्यक्रम।
Materials
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
Referências
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