Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Karolin Bomhardt; Pascal Schneider; Andr&#233; Portz; Christoph  R. Gebhardt; Michael D&#252;rr

doi:10.3791/60487

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Química

Analyse des molécules complexes et de leurs réactions sur les surfaces au moyen de la desorption induite par les grappes/spectrométrie de masse d’ionisation

Published: March 01, 2020

doi:

10.3791/60487

Karolin Bomhardt*¹, Pascal Schneider*¹, André Portz¹, Christoph R. Gebhardt², Michael Dürr¹

¹Institute of Applied Physics and Center for Materials Research (LaMa),Justus Liebig University Giessen, ²Bruker Daltonik GmbH

Summary

Des_amas neutres d’énergie cinétique (lt; 0,8 eV/constituant) sont utilisés pour desorbiser des molécules de surface complexes telles que les peptides ou les lipides pour une analyse plus approfondie au moyen de la spectrométrie de masse à l’aide d’un spectromètre de masse de piège à ions. Aucune préparation spéciale de l’échantillon n’est requise, et une observation en temps réel des réactions est possible.

Abstract

La désorption/ionisation induite par les clusters neutres SO₂ (DINeC) est utilisée comme technique de désorption/ionisation très douce et efficace pour la spectrométrie de masse (MS) des molécules complexes et leurs réactions sur les surfaces. DINeC est basé sur un faisceau de clusters SO₂ impactant sur la surface de l’échantillon à faible énergie de cluster. Lors de l’impact de la surface des grappes, certaines molécules de surface sont desorées et ionisées par dissolvation dans le cluster impactant; à la suite de ce mécanisme de desorption de dissolvation-négocié, l’énergie basse de faisceau est suffisante et le processus de desorption est extrêmement doux. Les adsorbates de surface et les molécules dont la surface est composée peuvent être analysées. Des spectres clairs et sans fragmentation à partir de molécules complexes telles que les peptides et les protéines sont obtenus. DINeC ne nécessite aucune préparation d’échantillon spéciale, en particulier aucune matrice ne doit être appliquée. La méthode donne des informations quantitatives sur la composition des échantillons; molécules à une couverture de surface aussi faible que 0,1 % d’une monocouche peut être détectée. Des réactions de surface telles que l’échange de H/D ou la décomposition thermique peuvent être observées en temps réel et la cinétique des réactions peut être déduite. À l’aide d’une buse pulsée pour la génération de faisceaux d’amas, DINeC peut être efficacement combiné avec la spectrométrie de masse de piège à ions. La nature douce et sans matrice du procédé DINeC, combinée aux capacités MSⁿ du piège à ion, permet une analyse très détaillée et sans ambiguïté de la composition chimique d’échantillons organiques complexes et d’adsorbates organiques sur les surfaces.

Introduction

Les techniques d’analyse sensibles à la surface sont souvent basées sur des sondes de particules telles que des électrons à basse énergie, des atomes ou des ions qui interagissent fortement avec des échantillons solides. En conséquence, ils montrent une sensibilité de surface élevée et des informations détaillées sur la structure de la surface peuvent être obtenues¹. L’information chimique, cependant, est souvent limitée. À titre d’exemple, la spectroscopie par photoélectronique à rayons X peut fournir des informations quantitatives sur la composition atomique et sur l’environnement chimique moyen d’une espèce donnée (p. ex., les atomes de carbone d’une molécule organique adsorbée sur une surface²). Cependant, il est difficile d’obtenir des informations plus détaillées sur les molécules complexes à adsorbed de surface, telles que leur structure détaillée ou leurs sites de liaison, avec des techniques standard d’analyse de surface. D’autre part, le besoin de telles informations s’accroît avec l’intérêt croissant pour la fonctionnalisation de surface au moyen de molécules organiques. Les champs en expansion de la synthèse à la surface³ ou de la fonctionnalisation de surface par l’attachement des biomolécules⁴^,⁵ sont deux exemples proéminents. Dans tous ces domaines, des questions fondamentales sur les interactions adsorbate s’adsorbate et adsorbate sont étudiées afin de mieux comprendre les systèmes. Pour ces recherches, un maximum d’informations sur les molécules adsorbed est souhaitable.

En partie, la spectrométrie secondaire de masse d’ion (SIMS) peut donner de telles informations. Tout d’abord, SIMS est très sensible à la surface. Deuxièmement, comme les adsorbates pulvérisés et leurs fragments sont détectés au moyen de la SP, l’information bien au-delà de la composition atomique est obtenue. Selon la nature des espèces chimiques adsorbed sur la surface, il peut être identifié par sa masse moléculaire et le modèle de fragment observé dans le spectre de masse⁶. Les fragments induits par les ions primaires peuvent en effet aider à l’identification du matériel analysé. D’autre part, si la modification induite par l’ion primaire (fragmentation, réactions induites par les ions, mélange) de l’échantillon est trop forte, la plupart des informations sur l’état d’origine de l’échantillon sont perdues. Ainsi, d’importants efforts ont été entrepris pour réduire la fragmentation des SIMS (p. ex., en utilisant des grappes moléculaires chargées comme ions primaires⁷^,⁸^,⁹). Cependant, la fragmentation domine toujours les spectres SIMS de grandes macromolécules et d’échantillons biologiques¹⁰, limitant l’application de SIMS dans divers domaines.

Comme alternative, nous avons montré la desorption/ionisation induite par les amas neutres (DINeC) pour être une méthode d’ionisation douce et sans matrice qui a été employée avec succès pour l’analyse spectrométrique de masse des molécules complexes¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. DINeC est basé sur un faisceau de clusters moléculaires qui se composent de 10³ à 10⁴ SO₂ molécules (Figure 1). Lorsque les grappes ont un impact sur l’échantillon, elles interagissent de différentes façons avec les molécules à la surface et à la surface : premièrement, une partie de l’énergie cinétique du cluster est redistribuée et active la désorption. Fait de même, la molécule de desorbing est dissoute dans l’amas lors de l’impact de la surface du cluster¹¹^,¹⁸^,¹⁹ ( Figure1 et Figure 2). En d’autres termes, sur la base du moment de dipole élevé de SO₂, les amas servent très efficacement de matrice transitoire pour les analytes polaires. En conséquence, la desorption des molécules d’analyte a lieu à des énergies de faisceau aussi bas que 1 eV/molécule et au-dessous. La nature molle du processus de desorption est encore soutenue par le refroidissement rapide du système lorsque l’amas SO₂ se brise pendant et après l’impact de surface¹¹^,¹⁹. En conséquence de ces divers aspects, la desorption induite par les grappes de molécules complexes telles que les peptides, les protéines, les lipides et les colorants se produit sans aucune fragmentation des molécules de desorbing¹¹^,¹⁵; les spectres de masse typiques montrent le pic dominant à la valeur m/z de la molécule intacte ([M-H]^ou [M-H]^–, Figure 3). Selon le nombre et la nature des groupes fonctionnels dans la molécule, plusieurs cations chargées de la forme [M H]^{n ‘} sont observés¹¹^,¹⁵^,¹⁸. Pour les biomolécules, l’ionisation a généralement lieu par l’intermédiaire de l’admission ou de l’abstraction d’un proton à un groupe fonctionnel de base ou acide, respectivement¹¹. Si des molécules d’eau sont présentes dans l’échantillon, LES molécules SO₂ de l’amas peuvent réagir avec ces molécules d’eau formant de l’acide sulfureux¹⁸. Ce dernier peut agir comme une source efficace de protons qui favorise davantage le processus d’ionisation en cas d’ionisation par l’intermédiaire de l’utilisation de protons (mode ion positif)¹³^,¹⁸.

Figure 1 : Illustration schématique de la désorption/ionisation induite par les grappes et de la mise en place expérimentale. La désorption/ionisation induite par le cluster est effectuée dans un récipient à vide élevé. Un faisceau de SO₂ clusters (points jaunes) est produit par l’expansion supersonique d’un mélange de gaz SO₂/He à partir d’une buse pulsée. Lors de l’impact de la surface des grappes, les molécules de surface sont desorées et ionisées. Les ions moléculaires (points rouges/oranges) sont transférés via une grille biaisée, une double entrée d’entonnoir ionique et des guides d’ions octopolaires dans le piège ionique pour la spectrométrie de masse. Les spectres de masse typiques montrent des pics dominants aux valeurs m/z des molécules intactes, ici : M1 (orange) et M2 (rouge) en mode ion positif. Explosion : Lors de l’impact de la surface du cluster, les molécules desorbed sont dissoutes dans le cluster impactant ou l’un de ses fragments. L’éclatement et l’évaporation supplémentaires des molécules so₂ conduisent alors à l’ion moléculaire nu et intact tel qu’détecté dans le spectromètre de masse. Voir aussi Figure 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Instantanés de simulations de dynamique moléculaire illustrant la désorption induite par les grappes par dissolvation. (A) Un amas SO₂ (300 molécules) s’approche de la surface avec 1250 m/s perpendiculaireà à la surface sur laquelle un dipeptide (acide-arginine aspartique, ASP-ARG) est adsorbed. (B) Lors de l’impact de la surface du cluster, le cluster se brise. Le dipeptide adsorbed interagit avec les molécules environnantes so₂ conduisant à sa dissolvation dans l’un des fragments de cluster. (C) Les fragments d’amas sont repoussés de la surface. Le fragment étiqueté (cercle bleu) porte le dipeptide qui est desorbé dans ce fragment. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Spectre de masse représentatif et modèle moléculaire de l’angiotensine II. (A) Spectres de masse (panneau supérieur : mode ion positif, panneau inférieur : mode ionique négatif) tel qu’obtenu après la désorption/ionisation induite par le cluster à partir d’un échantillon d’angiotensine II. L’échantillon a été préparé en jetant la solution respective sur une plaquette Si (couverte par son oxyde naturel). Les principaux pics sont attribués à la biomolécule intacte, [M-H]^et [M-H]^–; aucun modèle de fragmentation n’est observé. Les douilles ([2M-H]^,flèche) indiquent en outre la nature douce du processus de desorption. Le signal ionique positif est plus intense en raison de l’influence des clusters SO₂ ¹⁸. (B) Modèle de remplissage de l’espace et séquence d’acide aminé de l’angiotensine II. Les boules blanches indiquent des atomes d’hydrogène ; noir: carbone; bleu: azote; rouge: oxygène. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

DINeC peut être appliqué à n’importe quel type d’échantillon solide qui est compatible avec des conditions à vide élevé. Aucune préparation spéciale d’échantillon n’est exigée, en particulier aucune matrice n’a à être appliquée avant des mesures d’INeC-MS, contrairement à la spectrométrie de masse de dessorption/ionisation de laser matrix-assistée (MALDI) et aux techniques connexes²⁰^,²¹. Cela permet des mesures en temps réel des changements chimiques de l’échantillon avec des conditions expérimentales variables telles que la pression de fond des espèces réactives dans la chambre à vide²² ou la température de l’échantillon. La limite de détection de DINeC-MS a été montrée pour être dans la gamme femtomole¹¹. Lorsqu’il est appliqué à l’analyse des biomolécules adsorbed sur les surfaces solides dans le régime de sous-monocouche, une couverture de surface aussi bas que 0,1% d’un monocouches a été détectée²³. Dans ce régime de couverture, l’intensité du signal dépend linéairement de la couverture de surface et DINeC-MS peut être utilisé pour l’analyse quantitative de la composition de surface²³. Dans le cas d’échantillons mixtes, une évaluation quantitative de la composition de l’échantillon est possible¹⁷^,²⁴, car aucun effet majeur de l’environnement chimique sur la probabilité d’ionisation n’est observé (p. ex., dans le cas des échantillons mixtes de lipides/peptides¹⁷). Ceci contraste clairement avec le SIMS, pour lequel la probabilité d’ionisation d’une espèce donnée est généralement fortement influencée par la présence de différents composants chimiques (l’«effet matriciel»²⁵^,²⁶).

En plus de l’analyse de surface, la composition chimique dans la région souterraine peut être sondée au moyen d’un profilage de profondeur¹⁷. Avec la configuration actuelle, les taux typiques de desorption induite par les grappes de biomolécules sont de l’ordre de 10^-3 nm/s. Une résolution de haute profondeur de l’ordre de 1 à 2 nm a été observée pour les échantillons mixtes de lipides/peptides¹⁷.

Un autre champ d’application est la combinaison de DINeC-MS avec la chromatographie de couche mince (TLC). Les plaques TLC conventionnelles peuvent être analysées directement au moyen de dINeC-MS. Les spectres de masse dépendants de la position peuvent être acquis à partir des plaques TLC et ainsi des chromatogrammes spécifiques à la masse peuvent être obtenus à partir des plaques TLC²⁷. Aucune ré-élution des analytes séparés n’est nécessaire, différente de TLC en combinaison avec ESI²⁸^,²⁹. Aucune matrice n’est nécessaire pour la combinaison DINeC-MS TLC non plus, contrairement au couplage de TLC avec MALDI²⁸^,²⁹.

L’ionisation par électrospray de desorption (DESI) est également une méthode douce de desorption/ionisation pour les applications DeS³⁰^,³¹. Les différences les plus frappantes entre DINeC et DESI sont: la nature quantitative de DINeC²³, sa compatibilité avec les conditions ultra-haute-vide (UHV), en particulier la possibilité d’étudier les échantillons préparés et transférés dans des conditions UHV sans briser le vide²³, ainsi que la possibilité de desorb efficacement molécules non polaires¹⁹.

En principe, DINeC en tant que source de desorption/ionisation peut être couplé à n’importe quel type de spectromètre de masse. Cependant, la combinaison avec la spectrométrie de masse de piège d’ion comporte deux avantages principaux : d’abord, la largeur d’impulsion et le taux de répétition d’un faisceau pulsé typique de faisceau correspondent très bien au temps d’accumulation discontinu aussi bien que le taux spectral du piège d’ion^15,^32. Deuxièmement, la nature molle du processus DINeC conduit à la desorption de molécules intactes. En combinaison avec les capacités MSⁿ de la spectrométrie de masse de piège à ion, cela permet une analyse plus complète des échantillons étudiés¹⁵.

Protocol

REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause à tout moment. 1. Préparation des substrats Pour les échantillons standard, couper les substrats des plaquettes de silicium (épaisseur d’environ 0,5 à 1 mm) en morceaux de 1 x 1 cm2. Nettoyer les substrats Si dans un bain à ultrasons d’éthanol et d’acétone pendant 15 min chacun. Séchez les substrats dans un flux de gaz azoté sec. 2. Préparation d’échantillons Préparation standard de l’échantillon Pour les échantillons standard, préparer la solution contenant les molécules d’analyte en fonction de la question scientifique à traiter. La concentration de l’analyte doit être d’au moins 1 x 10-10 mol/L. Déposer 5 à 30 L de la solution de l’échantillon sur le substrat. Selon la pression de vapeur du solvant, laisser sécher l’échantillon dans des conditions ambiantes ou dans un dessiccateur jusqu’à ce que tout le solvant ait été évaporé et qu’un film sec ait été formé. Selon la quantité de substance appliquée, l’épaisseur du film peut se siévisser entre plusieurs dix m (inspection visuelle possible) et le régime monocouche à sous-monocouche (donc non détectable par l’œil). Monter les échantillons sur le porte-échantillon (p. ex., à l’aide de ruban adhésif ou de pinces serrées par des vis, selon les échantillons et les conditions de vide requises). Si possible, montez en outre un échantillon de référence tel qu’un film micrométrique d’angiotensine II, sur le support de l’échantillon. Préparation d’échantillons alternatifs Utilisez d’autres schémas de préparation d’échantillons tels que le dépôt de faisceaudi d’ion électrospray (ES-IBD) dans le sous-vide ou le revêtement de trempage dans une solution respective, le cas échéant. Échantillons de mont qui doivent être préparés et transférés sous vide sur le porte-échantillon DINeC avant les étapes de préparation. Assurez-vous que les échantillons enrobés de trempette sont secs après l’étape finale de préparation. Considérez le schéma de préparation le plus simple. Par exemple, pour l’étude de l’encre de surligneur, il suffit de dessiner un point sur la surface du substrat. 3. Transfert d’échantillons dans un spectromètre de masse DINeC Transfert d’échantillons provenant des conditions ambiantes dans la chambre DINeC évacuée Ventlez le système de verrouillage de charge. Ouvrez le verrou de chargement et montez le support de l’échantillon. Fermez le verrou de charge et pompez la chambre de verrouillage de charge à une pression inférieure à 2 x 10-5 mbar. Ouvrez la vanne à la chambre DINeC et transférez le support de l’échantillon avec la tige de transfert au manipulateur principal. Fixez le support de l’échantillon au manipulateur. Retirez la tige de transfert et fermez la soupape entre le verrouillage de charge et la chambre DINeC. Transfert d’échantillons du vide dans la chambre DINeC évacuée Utilisez un récipient à vide transportable, qui peut être fixé à la bride CF40 de la chambre DINeC. Transférer les échantillons, qui ont été préparés dans le vide, avec ce récipient sans briser le vide. Assurez-vous que les échantillons sont montés sur un support d’échantillon compatible avec le manipulateur utilisé dans le système DINeC. Fixez le conteneur à vide transportable à la bride CF40 et pompez le volume entre le conteneur et la chambre DINeC. Une fois que la pression est tombée en dessous de 2 x 10-5 mbar, ouvrez les vannes de la porte à la chambre DINeC et au récipient à vide transportable et transférez l’échantillon dans la chambre DINeC sur le manipulateur à l’aide d’un bâton ou d’un autre système de transfert avec un mouvement linéaire de plus de 50 cm. Retirez le système de transfert et fermez les deux vannes de porte. 4. Préparation du mélange de gaz Préparer un mélange d’environ 3% SO2 en hélium en évacuant d’abord les bouteilles de gaz du système de mélange de gaz pendant 10 min. Remplissez les cylindres avec SO2 jusqu’à ce qu’une pression de 1 barre soit atteinte. Remplissez encore les cylindres d’hélium jusqu’à ce qu’une pression totale de 30 barres soit atteinte.CAUTION: Lors de l’utilisation de SO2, les précautions de sécurité respectives telles que le stockage so2 cylindres dans des armoires à gaz désignées doivent toujours être remplies. 5. Préparation du spectromètre de masse DINeC Ouvrez la soupape entre la bouteille de gaz et la buse. Ajuster la pression du mélange de gaz SO2/Heau contour du système de mélange de gaz à 15 barres. Placez la position du manipulateur à la position de l’échantillon de référence. Pour mesurer les spectres de masse cationiques, fixez le biais de l’échantillon et de la grille à 40 et 7 V, respectivement. Pour conduire la buse pulsée et le spectromètre de masse de piège à ion, configurez le générateur de fonction externe à 2 Hz. Avec le générateur de retard, régler le délai entre le signal de piège clair du piège à ion et le signal de déclenchement de la buse pulsée à 5 ms. Dans le logiciel de contrôle, ajustez les paramètres suivants en appuyant sur les boutons respectifs ou en tapant les valeurs respectives dans la page Mode de la fenêtre de dialogue principale : Mode Scan: Résolution améliorée, Gamme: m/z 50 à 3000, Temps accu: 0,1 ms, Moyenne: 10 cycles, Polarité: positif pour la mesure des spectres de masse cationiqueREMARQUE : Pour mesurer les spectres anioniques, le biais de l’échantillon et de la grille doit être négatif en ce qui concerne le sol, Polarity doit être commuté à négatif dans le logiciel de contrôle. 6. Mesure des spectres de masse Une fois qu’une pression inférieure à 3 x 10-6 mbar a été atteinte dans la chambre DINeC, la mesure peut être commencée. Démarrez la mesure en appuyant d’abord sur Stand by puis en appuyant sur Opérer dans le logiciel de contrôle. Commencez à enregistrer les mesures en appuyant sur le bouton Play. Mesurer un spectre d’essai à partir d’un échantillon de référence tel que l’angiotensine II pendant environ 300 s. Suivez la dépendance temporelle du signal à l’aide du Chromatogram réglé à la valeur m/z respective. Optimisez l’intensité du signal en ajustant le délai de tempsentre le signal de piège clair et le signal déclenchant la buse pulsée. Déplacez le manipulateur à la position de l’échantillon à mesurer. Optimisez l’intensité du signal en ajustant la position de l’échantillon à l’intérieur du plan du porte-échantillon. Acquérir des spectres de masse sur la durée d’intérêt. Modifier les paramètres expérimentaux tels que la température de l’échantillon ou la pression de fond dans la chambre en fonction des détails de l’expérience. Continuer à prendre des spectres de masse en variant les paramètres expérimentaux. 7. Évaluation des données Une fois la mesure terminée, chargez l’ensemble de données respectifs dans le programme d’analyse de données. Sélectionnez la durée d’intérêt dans le chromatogramme avec le bouton droit de la souris. Le spectre moyen sera affiché dans une fenêtre séparée. Exporter le spectre comme fichier de données pour un traitement ultérieur dans un programme de choix.

Representative Results

Dans ce qui suit, deux exemples pour l’application en temps réel de DINeC-MS sont présentés. La figure 4 montre le changement du spectre de masse obtenu à partir de l’angiotensine II lorsque l’échantillon est chauffé jusqu’à environ 140 oC. Lorsque la température finale est atteinte (Figure 4B, Figure 4E), le spectre est caractérisé par un pic supplémentaire indiquant la perte d’une entité H2O(m/z ‘ 1029). Lors du maintien de l’échantillon à cette température, on observe une décomposition ultérieure des molécules d’angiotensine II (Figure 4C), y compris la perte d’une des unités d’acides aminés terminales, l’acide aspartique (pic à m/z – 932, figure 4D). L’analyse quantitative des données permet d’évaluer la cinétique de réaction sous-jacente (Figure 4E). En particulier, la figure 4E démontre que l’entité avec m/z 1029 est un intermédiaire qui se décompose davantage en fragments plus petits à mesure que l’intensité augmente, puis diminue. Les constantes de taux concomitantes sont donc dans le même ordre de grandeur. À titre de deuxième exemple, l’étude de l’échange d’hydrogène et de deutérium dans l’angiotensineII 22 est illustrée dans la figure 5. Lors de l’exposition de l’échantillon d’angiotensine à D2O dans la chambre DINeC (pD2O – 10-4 mbar), le modèle isotopique de l’angiotensine II est élargi et déplacé vers des valeurs plus élevées de m/z indiquant l’échange des atomes H par D. Le processus est rapide au cours des 60 premiers s, mais ralentit considérablement au cours de l’expérience : le modèle isotopique de la figure 5B couvre une large portée m/z (environ 15 m/z unités). Lorsque nous définissons le degré de deutération d comme le nombre d’atomes H échangés dans une molécule, les valeurs de d entre d ‘0 à d ’13 peuvent être extraites du spectre. Dans la figure 5C, le modèle isotopique est de nouveau réduit en largeur. Cette observation peut être attribuée à l’intensité fortement réduite des pics qui sont associés aux plus bas degrés de deutration. Dans la figure 5D, le spectre est affiché pour des temps de réaction encore plus longs. La plage couverte de m/z reste presque la même, mais le centre de masse du spectre se déplace encore lentement vers l’augmentation des valeurs m/z. Pendant de longues périodes d’exposition, une partie des molécules atteint le plus haut degré de deutération, dmax 17. Il correspond au nombre maximum d’atomes H échangeables, donné par le nombre d’atomes H liés à des groupes fonctionnels tels que les acides carboxyliques ou les groupes d’amine. Déjà de l’évolution temporelle des spectres, on peut déduire que l’échange H/D a lieu avec différentes constantes de taux. Pour une description quantitative de cette observation, le degré moyen de deutration est tracé à la figure 5E en fonction du temps. L’inspection des résultats expérimentaux (symboles) révèle trois régimes différents : une augmentation rapide de d ‘operative pour t ‘lt; 50 s, un régime intermédiaire pour 50 s lt; t ‘lt; 200 s, et une augmentation lente mais presque continue pour t ‘gt; 200 s. Les résultats expérimentaux ont été simulés au moyen de simulations de Monte Carlo; pseudo-premier ordre de réaction cinétique avec des constantes de réaction ki ont été supposés pour l’échange H/D aux groupes fonctionnels des molécules étudiées22. Un bon accord entre les simulations et les résultats expérimentaux dans les trois régimes n’a été obtenu que lorsqu’au moins trois constantes de taux différentes ki pour l’échange H/D dans les molécules d’angiotensine II ont été appliquées. Dans la figure 5F,G, la cinétique telle qu’elle a été déduite de l’ajustement des modèles d’isotopes expérimentaux par la somme des modèles d’isotopes pour différents degrés de deutration ( figure5A à figure 5D) sont montrées. Le bon accord entre les données expérimentales et les simulations ainsi que les taux de change très différents pour les degrés faibles et élevés de deutrations sont clairement observés. En comparaison avec différents oligopeptides tels que l’hexaglycine, les taux de change rapides ont été attribués aux groupes fonctionnels explicites, tandis que les taux de change lents ont été associés aux groupes amide de l’épine dorsale du peptide22. Alors que ces deux premiers exemples ont été mesurés à l’aide d’échantillons d’angiotensine II d’épaisseur micrométrique, la figure 6 montre les résultats obtenus à partir de la couverture sous-monocouche de l’angiotensine II sur des échantillons d’or, telle qu’elle a été préparée au moyen d’un dépôt électrospray à faisceau ionique (ES-IBD)23. Une dépendance linéaire de l’intensité du signal sur la quantité de substance est observée sur 3 ordres de grandeur, la plus faible quantité de substance détectée correspond à 0,1% d’une monocouche de molécules d’angiotensine II sur la surface de l’or. Des expériences d’échange De H/D telles qu’elles sont illustrées dans la figure 5 ont également été réalisées avec de l’angiotensine II sur de l’or dans le régime de sous-monocouche23. Figure 4 : Observation en temps réel de la dégradation thermique de l’angiotensine II. (A-C) Spectres de masse obtenus après desorption/ionisation induite par le cluster à partir d’un échantillon d’angiotensine II. (A) Échantillon frais à RT. (B) Échantillon chauffé à environ 140 oC. En plus du pic à m/z 1047, qui est associé à la molécule intacte [M-H],les pics à m/z ‘ 932, 1012, et 1029 apparaissent (indiqués par des flèches). (C) Ces derniers pics augmentent et le pic principal diminue avec le temps pour maintenir l’échantillon à une température élevée. (D) Formule structurelle d’angiotensine II indiquant le fragment (parenthèses brunes) qui conduit à l’apparition du pic à m/z 932 par la perte d’une unité d’acide aminé (acide aspartique). (E) Dépendance temporelle de la température de l’échantillon et de l’intensité des crêtes principales indiquées dans les parcelles (A) à (C). Les lignes solides sont des guides pour l’œil. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Observation en temps réel de l’échange H/D en angiotensine II. (A-D) Spectres de masse cationnaires de l’angiotensine II obtenues au moyen de DINeC-MS. En raison de l’échange de H/D, le modèle isotopique s’élargit et se déplace vers des valeurs plus élevées de m/z dans (B) à (D) par rapport au modèle isotopique des espèces non dédulées montrées dans (A). Les lignes rouges sont des données, les lignes cyan pointillées sont adaptées aux données en tenant compte des différents degrés de deutration. (E) Degré moyen de deutration d ‘en fonction du temps tel qu’déduit des expériences (points ouverts). En outre, d ‘ en fonction du temps déduit au moyen de simulations de Monte Carlo est montré. Courbe pointillée noire : simulations en tenant compte d’un taux constant(k1); courbe rouge : en tenant compte de trois constantes de taux (k1, k2, k3). (F,G) Intensités relatives du signal de certains degrés de deutération de l’angiotensine II (symboles et lignes solides) en fonction du temps avec les résultats correspondants des simulations de Monte Carlo (lignes pointillées). Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 22. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 6 : Application de DINeC-MS à l’angiotensine II sur l’or dans le régime de la sous-monocouche. (A) Représentation schématique de la combinaison de l’ES-IBD pour le dépôt et du DINeC-MS pour la spectrométrie de masse des molécules isolées d’angiotensine II dans le régime de submonocouche. (B) Dépendance de l’intensité du signal sur la quantité de substance déposée sur l’échantillon telle qu’obtenue à partir de deux ensembles de données indépendants (symboles remplis et ouverts). Insets: Spectres de masse DINeC obtenus à partir d’échantillons sur lesquels une quantité de substance a été déposée comme indiqué. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 23. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Dans beaucoup d’études réalisées jusqu’ici, une sensibilité élevée de DINeC-MS sur diverses substances a été démontrée. En effet, cela permet de mesurer les analytes jusqu’à une quantité de substance dans le régime femtomole¹¹. En raison de cette sensibilité élevée, la préparation de l’échantillon, en particulier le nettoyage du substrat, doit être effectuée avec des produits chimiques très purs afin d’éviter la contamination dans les spectres de masse DINeC. Comme c’est le cas pour de nombreuses techniques d’analyse, une mesure de fond appropriée à partir d’un substrat vide aide à séparer les pics de l’analyte et les pics qui ont leur origine dans la préparation du substrat / échantillon.

Bien que nous ayons montré que la probabilité d’ionisation d’une molécule analyte donnée n’est pas fortement influencée par la présence de co-adsorbates ou de co-constituants dans des échantillons mixtes¹⁷^,²⁴, la probabilité d’ionisation peut varier d’une substance à l’autre¹³. Ainsi, il est encore plus important de travailler dans des conditions propres que les contaminants, en fonction de leur probabilité d’ionisation, peuvent contribuer au signal beaucoup plus fort que l’analyte. Les ions préformés (p. ex., comme on le trouve dans le cas de nombreuses molécules de colorant) ou les molécules avec des groupes fonctionnels qui montrent une nette tendance à l’apport ou à la déprotonation des protons (c.-à-d. bases ou acides), présentent généralement une forte probabilité d’ionisation dans DINeC-MS. Si aucun groupe fonctionnel de ce type n’est présent dans l’analyte, la probabilité d’ionisation peut être faible. Les échantillons peuvent ensuite être traités par des agents ionisants tels que l’acide trifluoro (p. ex., par exposition de l’échantillon à la pression de vapeur de l’agent ionisant).

Les résultats représentatifs discutés à la figure 4 et à la figure 5 démontrent l’applicabilité de DINeC-MS pour les enquêtes en temps réel sur les réactions chimiques au moyen de la spectrométrie de masse. La figure 6 illustre la sensibilité submonocouche de la méthode. Si les deux propriétés sont combinées, les réactions chimiques sur les surfaces et leurs produits peuvent être suivies en temps réel²³. Cela peut être particulièrement intéressant pour ce qu’on appelle la « synthèse sur surface » qui conduit à l’assemblage des structures macromoléculaires sur les surfaces³^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶. Dans la configuration actuelle, l’observation de telles réactions de surface est possible sur des surfaces avec une réactivité plus faible comme l’or²³ et d’autres métaux nobles; les expériences sont plus difficiles à effectuer sur des surfaces très réactives telles que les surfaces de silicium³⁷, car la pression de base dans la chambre de desorption est dans la gamme 10^-7-mbar. Les activités actuelles portent sur cette limitation et un appareil DINeC compatible UHV est en cours de construction. Dans le cas des surfaces réactives, l’interaction entre SO₂ et la surface du substrat doit être testée avant les mesures des adsorbates de surface et des réactions de surface.

Comme le faisceau d’amas est neutre, il ne peut pas être concentré. La taille du faisceau sur l’échantillon est ainsi donnée par la géométrie de la configuration et de l’orifice de l’écumeur en cours d’utilisation; les valeurs typiques pour le diamètre du faisceau sur l’échantillon sont de un à plusieurs millimètres. Par conséquent, l’imagerie par balayage de l’échantillon n’est possible qu’avec une très faible résolution. D’autre part, donné par la forte probabilité d’ionisation¹³, DINeC fait efficacement usage des molécules desorbed. Ainsi, une combinaison de DINeC-MS et d’un détecteur d’imagerie^{ionique 38} semble très attrayante.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent le soutien financier du Helmholtz International Center for FAIR (HICforFAIR) et de la Helmholtz Graduate School for Hadron and Ion Research (P.S.). Les auteurs remercient le professeur Rauschenbach (Université d’Oxford) et son équipe pour leur collaboration fructueuse sur les expériences combinées ES-IBD/DINeC.

Materials

Acetone rotisolv HPLC	Roth	7328.2	HPLC Gradient Grade
Copper tape
Ethanol rotisolv HPLC	Roth	p076.1	HPLC Gradient Grade
Helium	Praxair	4800086706	Purity 99.9999%
Nitrogen	Praxair	40728408	Purity 99.5 – 100%
Silicon Wafers	Active Business Company GmbH	G60007
Sulfur dioxide	Air Liquide	P1734S10R0A001	Purity 99.98%
Water rotisolv LC-MS	Roth	HN43.1	Ultra LC-MS

Referências

Vickerman, J. C., Gilmore, I. . Surface Analysis: The Principal Techniques. , (2009).
Reutzel, M., Münster, N., Lipponer, M. A., Länger, C., Höfer, U., Koert, U., Dürr, M. Chemoselective Reactivity of Bifunctional Cyclooctynes on Si(001). Journal of Physical Chemistry C. 120, 26284-26289 (2016).
Grill, L., Dyer, M., Lafferentz, L., Persson, M., Peters, M., Hecht, S. Nano-architectures by covalent assembly of molecular building blocks. Nature Nanotechnol. 2, 687-691 (2007).
Stutzmann, M., Garrido, J. A., Eickhoff, M., Brandt, M. S. Direct biofunctionalization of semiconductors: A survey. Physica Status Solidi A. 203, 3424-3437 (2006).
Adler-Abramovich, L., Gazit, E. The physical properties of supramolecular peptide assemblies: from building block association to technological applications. Chemical Society Reviews. 43, 6881-6893 (2014).
Vickerman, J. C., Briggs, D. . TOF-SIMS: Materials Analysis by Mass Spectrometry, 2nd ed. , (2013).
Winograd, N. The magic of cluster SIMS. Analytical Chemistry. 77, 142-149 (2005).
Ichiki, K., Ninomiya, S., Nakata, Y., Honda, Y., Seki, T., Aoki, T., Matsuo, J. High Sputtering Yields of Organic Compounds by Large Gas Cluster Ions. Applied Surface Science. 255, 1148-1150 (2008).
Mochiji, K., Hashinokuchi, M., Moritani, K., Toyoda, N. Matrix-free Detection of Intact Ions from Proteins in Argon-Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23, 648-652 (2009).
Yokoyama, Y., Aoyagi, S., Fujii, M., Matsuo, J., Fletcher, J. S., Lockyer, N. P., Vickerman, J. C., Passarelli, M. K., Havelund, R., Seah, M. P. Peptide Fragmentation and Surface Structural Analysis by Means of ToF-SIMS Using Large Cluster Ion Sources. Analytical Chemistry. 88, 3592-3597 (2016).
Gebhardt, C. R., Tomsic, A., Schröder, H., Durr, M., Kompa, K. L. Matrix-Free Formation of Gas-Phase Biomolecular Ions by Soft Cluster-Induced Desorption. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 4162-4165 (2009).
Baur, M., Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Durr, M. Soft Clusterinduced Desorption and Ionization of Biomolecules – Influence of Surface Load and Morphology on Desorption Efficiency. Applied Physics Letters. 99, 234103 (2011).
Lee, B. J., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Quantification of the Ionization Probability During Desorption/Ionization of Oligopeptides Induced by Neutral Cluster Impact. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 27, 1090-1094 (2013).
Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Schroder, H., Kompa, K. L., Durr, M. Observation of Ionic Desorption Channels in Cluster-induced Desorption of Alkali Halides – Influence of Surface Electronic Properties and Surface Configuration. Chemical Physics Letters. 556, 77-81 (2013).
Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact as a Soft and Efficient Ionization Source for Ion Trap Mass Spectrometry of Biomolecules. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28, 290-296 (2014).
Kley, C. S., Dette, C., Rinke, G., Patrick, C. E., Cechal, J., Jung, S. J., Baur, M., Durr, M., Rauschenbach, S., Giustino, F., Stepanow, S., Kern, K. Atomic-Scale Observation of Multiconformational Binding and Energy Level Alignment of Ruthenium-Based Photosensitizers on TiO2 Anatase. Nano Letters. 14, 563-569 (2014).
Portz, A., Aoyagi, S., Durr, M. Soft depth-profiling of mixed peptide/lipid samples by means of cluster induced desorption/ionization mass spectrometry – high depth resolution and low matrix effect. Biointerphases. 13, 03B405 (2018).
Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Frank, A. J., Neuderth, P., Eickhoff, M., Durr, M. Influence of the Cluster Constituents’ Reactivity on the Desorption/Ionization Process Induced by Neutral SO2 Clusters. Journal of Chemical Physics. 146, 134705 (2017).
Schneider, P., Durr, M. Cluster-induced desorption investigated by means of molecular dynamics simulations – Microsolvation in clusters of polar and non-polar constituents. Journal of Chemical Physics. 150, 214301 (2019).
Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10 000 Daltons. Analytical Chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90, 240-265 (2018).
Portz, A., Gebhardt, C. R., Durr, M. Real-Time Investigation of the H/D Exchange Kinetics of Porphyrins and Oligopeptides by Means of Neutral Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Journal of Physical Chemistry B. 121, 11031-11036 (2017).
Portz, A., Baur, M., Rinke, G., Abb, S., Rauschenbach, S., Kern, K., Dürr, M. Chemical Analysis of Complex Surface-Adsorbed Molecules and Their Reactions by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90, 3328 (2018).
Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Mass Spectrometry of Oligopeptides in the Presence of Large Amounts of Alkali Halides Using Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact. Biointerphases. 11, 02A316 (2016).
Shard, A. G., Spencer, S. J., Smith, S. A., Havelund, R., Gilmore, I. S. . International Journal of Mass Spectrometry. 377, 599-609 (2015).
Nakano, S., Yamagishi, T., Aoyagi, S., Portz, A., Durr, M., Iwai, H., Kawashima, T. Evaluation of Matrix Effects on TOF-SIMS Data of Leu-enkephalin and DOPC Mixed Samples. Biointerphases. 13, 03B403 (2018).
Heep, J., Tuchecker, P. H. K., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. ACS Omega. 4, 22426-22430 (2019).
Morlock, G., Schwack, W. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 29, 1157-1171 (2010).
Cheng, S. C., Huang, M. Z., Shiea, J. Thin layer chromatography/mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218, 2700-2711 (2011).
Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306, 471 (2004).
Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science. 311, 1566 (2006).
Dürr, M., Gebhardt, C. Ion generation in mass spectrometers by cluster bombardment. US Patent. , (2019).
Lindner, R., Kuhnle, A. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. ChemPhysChem. 16, 1582-1592 (2015).
Dong, L., Liu, P. N., Lin, N. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. Accounts of Chemical Research. 48, 2765-2774 (2015).
Björk, J. Reaction mechanisms for on-surface synthesis of covalent nanostructures. Journal of Physics: Condensed Matter. 28, 083002 (2016).
Rauschenbach, S., Rinke, G., Gutzler, R., Abb, S., Albarghash, A., Le, D., Rahman, T. S., Durr, M., Harnau, L., Kern, K. Two-Dimensional Folding of Polypeptides into Molecular Nanostructures at Surfaces. ACS Nano. 11, 2420-2427 (2017).
Dürr, M., Höfer, U. Dissociative adsorption of molecular hydrogen on silicon surfaces. Surface Science Reports. 61, 465-526 (2006).
Zhang, J., Franzreb, K., Aksyonov, S. A., Williams, P. Mass Spectra and Yields of Intact Charged Biomolecules Ejected by Massive Cluster Impact for Bioimaging in a Time-of-Flight Secondary Ion Microscope. Analytical Chemistry. 87, 10779-10784 (2015).

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Bomhardt, K., Schneider, P., Portz, A., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60487, doi:10.3791/60487 (2020).