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Medicina

Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

Published: November 07, 2019
doi:
10.3791/60472
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1Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation,Children’s National Hospital, 2Children’s National Heart Institute,Children’s National Hospital, 3Center for Neuroscience Research,Children’s National Hospital, 4Department of Biomedical Engineering, School of Engineering,University of Alabama at Birmingham, 5Department of Pediatrics, Department of Pharmacology & Physiology, School of Medicine and Health Sciences,George Washington University

Summary

El objetivo de este estudio fue establecer un método para investigar la dinámica cardíaca utilizando un modelo animal traslacional. El enfoque experimental descrito incorpora optocardiografía de doble emisión junto con un estudio electrofisiológico para evaluar la actividad eléctrica en un modelo de corazón porcino aislado e intacto.

Abstract

Los modelos animales pequeños se utilizan más comúnmente en la investigación cardiovascular debido a la disponibilidad de especies modificadas genéticamente y menor costo en comparación con los animales más grandes. Sin embargo, los mamíferos más grandes son más adecuados para preguntas de investigación traslacional relacionadas con la fisiología cardíaca normal, la fisiopatología y las pruebas preclínicas de agentes terapéuticos. Para superar las barreras técnicas asociadas con el empleo de un modelo animal más grande en la investigación cardíaca, describimos un enfoque para medir los parámetros fisiológicos en un corazón de lechones aislado, perfundido con Langendorff. Este enfoque combina dos potentes herramientas experimentales para evaluar el estado del corazón: estudio de electrofisiología (EP) y mapeo óptico simultáneo de voltaje transmembrana y calcio intracelular utilizando colorantes sensibles a parámetros (RH237, Rhod2-AM). Las metodologías descritas son adecuadas para estudios traslacionales que investigan el sistema de conducción cardíaca, alteraciones en la morfología potencial de la acción, el manejo del calcio, el acoplamiento excitación-contracción y la incidencia de alternadores cardíacos o Arritmias.

Introduction

Las enfermedades cardiovasculares son una de las principales causas de enfermedad y muerte en todo el mundo. Como tal, un enfoque de investigación principal es optimizar metodologías que se pueden utilizar para estudiar la fisiología cardíaca normal y los mecanismos subyacentes que pueden contribuir a la morbilidad y mortalidad en los seres humanos. La investigación cardiovascular básica ha dependido tradicionalmente de pequeños modelos animales, incluidos roedores y conejos1,2,3, debido a la disponibilidad de especies modificadas genéticamente4,5, menor costo, menor huella experimental y mayor rendimiento. Sin embargo, el uso de un modelo de cerdo tiene el potencial de proporcionar datos más relevantes clínicamente6. De hecho, estudios previos han documentado similitudes en electrofisiología cardíaca (EP) entre humanos y cerdos, incluyendo corrientes iónicas similares7,forma potencial de acción8y respuestas a las pruebas farmacológicas9. Por otra parte, el corazón porcino tiene cinética contráctea y relajación que son más comparables a los seres humanos que los roedores o conejos10. En comparación con un modelo canino, la anatomía coronaria porcina se asemeja más a un corazón humano11,12 y es el modelo de elección para estudios centrados en el desarrollo del corazón, cardiología pediátrica y / o defectos cardíacos congénitos 13. Aunque hay diferencias entre el cerdo y el corazón humano8,estas similitudes hacen del corazón porcino un modelo valioso para la investigación cardiovascular14.

La perfusión retrógrada del corazón se ha convertido en un protocolo estándar para estudiar la dinámica cardiaca ex vivo15 desde su primera creación establecida por Oskar Langendorff16. En consecuencia, Langendorff-perfusión se puede utilizar para apoyar un corazón aislado, intacto en ausencia de influencias autonómicas. Este modelo es una herramienta útil para comparar directamente la electrofisiología cardíaca y la contractilidad entre corazones sanos y no sanos. Dado que la dinámica cardíaca es temporal y espacialmente compleja, una ligera alteración en una región puede afectar dramáticamente la capacidad de todo el corazón para trabajar como un sincitio17. Por lo tanto, la alta imagen espaciotemporal de los dedos sensibles a parámetros es una herramienta útil para monitorear la función cardíaca a través de la superficie del corazón18,19. De hecho, la imagen dual simultánea de sondas fluorescentes sensibles al voltaje y al calcio permite evaluar la actividad eléctrica, la manipulación de calcio y el acoplamiento excitación-contracción a nivel de tejido20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Las técnicas de perfusión y/o cartografía óptica de Langendorff se han utilizado previamente para documentar la disminución del rendimiento cardíaco debido al envejecimiento o a mutaciones genéticas, y para evaluar la seguridad de los agentes farmacológicos o las exposiciones ambientales29 ,30,31,32,33.

En el entorno clínico, a menudo se utiliza un estudio de electrofisiología cardíaca invasiva para investigar alteraciones del ritmo cardíaco, identificar patologías y identificar posibles opciones de tratamiento. Del mismo modo, describimos un protocolo EP que se puede utilizar para evaluar la función del nódulo sinusal, medir la conducción auriculoventricular e identificar la refractoridad del tejido miocárdico. El estudio EP descrito se puede realizar junto con la cartografía óptica, u optocardiografía34,para caracterizar completamente la fisiología cardíaca en corazones aislados. En el protocolo descrito, se realizaron imágenes de fluorescencia de alta resolución espaciotemporal con una combinación de tintes de voltaje (RH237) y calcio (Rhod-2AM) en una configuración de doble emisión. Además, los parámetros de electrofisiología cardíaca fueron monitoreados bajo el ritmo sinusal y en respuesta a la estimulación eléctrica programada.

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de Los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Octava Edición). Todos los métodos y protocolos utilizados en estos estudios han sido aprobados por el Comité Institucional de Protocolo de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Nacional Infantil siguiendo las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicadas por NIH. Todos los animales utilizados en este estudio recibieron cuidado humano de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Preparación Preparar 6 L de la solución modificada de Krebs-Henseleit16 (mM: 118.0 NaCl, 3.3 KCl, 1.2 MgSO4, 24.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 10.0 glucosa, 2.0 piruvato de sodio, 2% albúmina, 2.0 CaCl2). Añadir CaCl2 el día del experimento, ya que con el tiempo, en presencia de fosfatos, cloruro de calcio se precipitará terminalmente fuera de la solución como fosfato de calcio. Ajustar el pH a 7,4 después del filtrado estéril (tamaño de los poros: 0,22 m). Compruebe la osmolalidad de la solución para garantizar un rango de 275 a 310 mOsm/kg. Enfríe 1 L sobre hielo para su uso inmediatamente después de que se extirpade el corazón. Caliente 3 L en un baño de agua a aproximadamente 37 oC antes de burbujear con carboen (95% O2, 5% CO2).NOTA: El calentamiento minimiza las burbujas y la posible embolia, ya que el líquido frío tiene una mayor capacidad de gas para disolverse; por lo tanto, a medida que los medios modificados Krebs-Henseleit pasen a través del sistema de perfusión y se calienten, el gas se liberará como burbujas. Preparar 2 L de cardioplejia (solución cardioplejia del Nido modificada, Tabla 1). Congele suficiente cardioplejia en una bandeja de cubitos de hielo para llenar un vaso de precipitados de 500 ml. Encienda los baños de agua circulantes ajustados a 42 oC. Encienda las bombas para hacer circular el perfusado en un bucle de calentamiento hidrónico cerrado (para obtener una lista completa de materiales, véase la Tabla de materiales y la Figura 1).NOTA: Un baño de agua circulante calentado se utiliza para calentar los tubos con camisa de agua y los intercambiadores de calor. Limpie los circuitos y cámaras de tubos ejecutando 2 L de una solución de 1% de detergente universal en agua a través del sistema. Enjuague todos los circuitos de tubos y cámaras del sistema Langendorff con >4 L de agua purificada. Ejecuta bombas hasta que se haya eliminado toda el agua del sistema. Añadir un filtro de membrana sintética en línea con las bombas de perfusión (filtro de polipropileno, tamaño de poro > 5 m). Gas un oxigenador de microfibra (hemofiltro) con 95% O2 y 5% CO2 a 80 kPa.NOTA: Cuando se utiliza albúmina, a menudo hay espuma asociada con la oxigenación y / o la actividad de bombeo a través del circuito de tuberías. Un compuesto antiespuma (emulsión antiespuma Y30) se puede añadir con gota de forma ligera (cada 30 minutos) para atemple a medida que se produce. Compruebe una calibración de dos puntos (0 y 60 mmHg) para el sensor de presión situado por encima de la aorta o en la trampa de burbujas; calibrar según sea necesario. Inmediatamente antes de la escisión cardíaca, vierta el medio en el sistema de perfusión de bucle Langendorff. Asegúrese de que la perfusión pase a través de oxigenadores de microfibra (hemofiltros) gaseados con perfumar oxigenado, que luego fluye a través de intercambiadores de calor para mantener una temperatura de perfumar de medios de 37 oC en la aorta. Ajuste el baño de agua circulante a unos pocos grados más de 37 oC, como 42 oC, para tener en cuenta la pérdida de calor durante el intercambio y en todo el sistema. Supervise la temperatura de perfumar circulante con termopares. 2. Escisión cardíaca y perfusión de Langendorff Sedar el cerdo con una inyección intramuscular (I.M.) de ketamina (20 mg/kg) y xilazina (2 mg/kg) e intubar con un tubo endotraqueal. Para la inducción, administrar una inyección intravenosa (I.V.) de bolo de fentanilo (50 g/kg) y rocuronio (1 mg/kg). Mantener la anestesia con isoflurano inhalado (0,5 x 3%), fentanilo (10 x 25 g/kg) y pancuronio (1 mg/kg).NOTA: Para este estudio de prueba de principios, se utilizaron cerdos juveniles de Yorkshire (14-42 días de edad, n a 18) que oscilaron entre 2,5 x 10,5 kg de peso corporal y 18 a 137 g de peso cardíaco(Figura 2). Si es necesaria una inyección adicional para la inducción, se puede inyectar ketamina (10 mg/kg) I.M. Una vez que el animal esté completamente anestesiado y no responde, realice una esternotomía para exponer la aorta ascendente y la aurícula derecha. Usando un bisturí, haz una incisión de línea media desde la parte superior del esternón en la entrada torácica, hasta el proceso de xifoide. Con una cauterición (o tijeras), disecciona la grasa y el músculo subyacentes hasta que el esternón sea visible. Desde el proceso de xifoide, corte la línea media del esternón a través del manubrio con tijeras óseas quirúrgicas o una sierra ósea. Inserte retractores en la incisión para exponer el corazón. Entregar una dosis de bolo de heparina (300 U/kg) a las atrias derechas, utilizando una aguja y jeringa de 18 G, para minimizar los coágulos de mancha al escisión de los órganos. Coloque almohadillas absorbentes en la cavidad torácica y hielo alrededor del corazón. Con tijeras, corte cuidadosamente a través del pericardio, aísle la aorta por disección contundente del tejido conectivo circundante y sujete la aorta justo debajo de la primera rama arterial en el arco aórtico. Con una jeringa de 50 ml con una aguja de 18 G, inyecte cardioplejia helada (20 ml/kg) a través de la parte superior de la aorta ascendente. Corta los vasos que conducen al corazón y retira el corazón con la aorta ascendente intacta y sumerge el corazón extirpado en cardioplejia helada. Agarre las paredes de la aorta con un par de hemostats y deslícela sobre una cánula acanalada unida a tubos que conduzcan a 1 L de medios de cardioplejia helada suspendidos sobre el corazón (95 cm para proporcionar 70 mm Hg). Deje que el líquido entre y llene la aorta hasta que se desborde para evitar que alguna burbuja entre en la vasculatura.NOTA: El uso de un desacoplador mecánico (2,3-butanediona monoxime [BDM] o blebbistatin) disminuirá la tasa de perfusión coronaria a medida que disminuya la demanda de oxígeno del tejido. Asegure la aorta a la cánula usando cinta umbilical y ancle la cinta umbilical atando los hemostats para soportar el peso del corazón, que ahora cuelga de la cánula(Figura 1C). Permita que los medios fríos perforen retrogrados del corazón a una presión constante de 70 mmHg a través de la gravedad. Mantenga el corazón sumergido en cardioplejia fría hasta que esté listo para ser transferido al sistema de perfusión Langendorff caliente (37 oC) (<10 min).NOTA: La aorta en corazones más pequeños (3/8″ de diámetro interno) que permiten que las burbujas se eleven más rápido que la solución que entra en la aorta. Transfiera el corazón al sistema Langendorff (37 oC) sin introducir aire en la cánula. Permita que el ritmo sinusal normal enjuague la vasculatura de cualquier sangre y cardioplejia restantes.NOTA: En el estudio descrito se observó un caudal inicial promedio de 184 x 17 ml/min en corazones de lechones juveniles aislados. El caudal disminuyó a 70 x 7,5 ml/min (media de SEM) después de perfumar con medios calentados que contenían un desacoplador mecánico (20 mM de BDM). No sumerja el tejido cardíaco, ya que puede afectar a las imágenes cardíacas. La temperatura del tejido se mantiene por flujo coronario en el corazón del cerdo debido a su mayor volumen y menor superficie, en comparación con los roedores. Bajo el flujo completo, las temperaturas del epicardio y del endocardio oscilaban entre los 35 oC y los 37 oC, respectivamente.PRECAUCION: Use el equipo de protección personal adecuado, incluido el desgaste de los ojos cuando trabaje con acopladores mecánicos. El corazón puede expulsar los medios rápida e inesperadamente. Desfibrilar el corazón en caso de arritmias escandalosas (taquicardia ventricular, fibrilación ventricular) colocando paletas externas en el ápice y la base del corazón y dando un solo choque a 5 J, aumentando en incrementos de 5 J (o como seleccionable por el desfibrilador) hasta 50 J, cardioversión o ritmo inconmoble. Repita los amortiguadores a 50 J según sea necesario.NOTA: En el estudio presentado, el 89% de los preparados requirieron desfibrilación. Después del equilibrio (10 min), se observó una frecuencia cardíaca media de 70 a 4,5 bpm (media de SEM) para los corazones de lechones juveniles(Figura 2). Enjuague el corazón con al menos 1 L de medios Krebs-Henseleit modificados, sin recircular, para eliminar la sangre residual y la cardioplejia. Una vez que el medio se despeje a través del corazón, cierre el bucle circulante para recircular perperperperme. 3. Estudio de electrofisiología Para registrar un electrocardiograma estándar de plomo II (ECG) a lo largo del estudio, adjunte un electrodo de aguja de 29 G al epicardium ventricular cerca del ápice, con otro electrodo en la aurícula derecha. Conecte las entradas positivas y negativas de un bioamplificador diferencial al vértice y a la aurícula derecha, respectivamente. Coloque un electrodo de estímulo bipolar en las aurículas derechas y un segundo electrodo de estímulo bipolar en el ventrículo izquierdo lateral para fines de ritmo. Camina por el corazón usando un estimulador de electrofisiología, con la corriente inicial establecida en el doble del umbral diastólico (1 x 2 mA) y un ancho de pulso de 1 ms35,36.NOTA: Si la estimulación no logra obtener una respuesta, el ancho del pulso puede aumentarse hasta 2 ms. Se necesita más corriente (10x) con electrodos coaxiales grandes (estimulación bipolar). Identifique el umbral de ritmo aplicando una serie de impulsos de estímulo (1 a 2 mA, 1 ms de ancho de pulso) a longitudes de ciclo de ritmo definidas (PCL) para asegurar una respuesta de estímulo consistente.NOTA: Una vez establecida la tasa intrínseca, el tren de impulso inicial puede comenzar en un PCL ligeramente más corto. Realizar un ritmo adicional de estímulo usando un tren de ritmo S1-S1 o S1-S2, en este último un tren de 6 x 8 impulsos (S1) fue seguido por un solo impulso (S2). Disminuya el Pcl S2 escalonadamente en 10 ms (es decir, 200 ms, 190 ms, 180 ms, etc.) hasta que no pueda capturar. Suba al penúltimo PCL (es decir, 190 ms) y disminuya en intervalos de 1 ms para encontrar el PCL más preciso antes de la pérdida de captura (es decir, 184 ms).NOTA: Los mismos parámetros de estimulación se utilizan tanto para S1 como para S2 (1 a 2 mA, 1 ms de ancho de pulso). Consulte la Figura 3 para ver ejemplos representativos o valores publicados anteriormente en mediciones de electrofisiología cardíaca porcina37. Para establecer el período refractario efectivo ventricular (VERP), utilice el electrodo de estímulo en el ventrículo izquierdo lateral para identificar el intervalo S1-S2 más corto en el que el S2 (latido prematuro) inicia la despolarización ventricular.NOTA: El período refractario es el intervalo de acoplamiento S1-S2 más corto posible. Para definir la longitud del ciclo de Wenckebach (WBCL), utilice el electrodo de estímulo en la aurícula derecha para encontrar el intervalo S1-S1 más corto en el que la conducción auriculoventricular 1:1 se propaga a través de la vía de conducción normal.NOTA: Si no lo hace, representa un bloqueo cardíaco de 2odos. Para definir el tiempo de recuperación del nodo sinusal (SNRT), utilice el electrodo de estímulo en la aurícula derecha para aplicar un tren de ritmo (S1-S1) y medir el retardo de tiempo entre el último impulso en el tren de ritmo, y la recuperación de la actividad espontánea mediada por nodo sinoauricular. Para establecer el período refractario efectivo del nódodio auriculoventricular (AVNERP), utilice el electrodo de estímulo en la aurícula derecha para encontrar el intervalo de acoplamiento S1-S2 más corto en el que la estimulación auricular prematura es seguida por un haz de Su potencial que provoca un QRS complejo, lo que significa despolarización ventricular. 4. Mapeo óptico de voltaje transmembrana y calcio intracelular NOTA: Se debe utilizar un desacoplador mecánico para minimizar los artefactos de movimiento durante la cartografía óptica y para evitar la hipoxia3,38,39,40. (-/-) La blebbistatina (concentración circulante de 5 m) puede añadirse lentamente como una dosis de bolo de 0,5 mM en 5 ml de perfusato (100x de concentración final)41. Alternativamente, BDM puede incluirse inicialmente en el soporte perpermeado a una concentración circulante de 20 mM. Preparar el tinte de tensión disolviendo 5 mg de RH237 en 4 ml de DMSO anhidro. Diluir la alícuota de tinte con hasta 5 ml de medios y vórtice. Añadir lentamente RH237 (62,1 g por 500 ml de perfusato) proximal a la cánula aórtica.NOTA: El tejido miocárdico puede volver a teñirse con RH237, si es necesario, durante toda la duración del experimento. Preparar el tinte de calcio disolviendo 1 mg de Rhod2-AM en 1 ml de DMSO anhidro. Mezcle el tinte con 50 ml de ácido plurónico, colóquelo en un baño sonicador de 37 oC durante un máximo de 10 minutos y luego diluya con hasta 5 ml de medios. Añadir lentamente el tinte de calcio (50 g por 500 ml de perverto) proximal a la cánula aórtica.NOTA: Para garantizar una tinción uniforme del tinte, se deben añadir tintes lentamente (>30 s). Rhod-2AM tarda hasta 10 minutos en alcanzar el pico de fluorescencia, mientras que el RH237 mancha el corazón dentro de un 1 a 2 min. Se puede esperar el uso de la carga de tinte descrita, rangos de relación señal/ruido (SNR) de 42 a 86 y 35 a 69 para voltaje y calcio, respectivamente. Los valores SNR se pueden calcular como SNR (recuentos de pico a pico)/(Desviación estándar durante el intervalo diastólico)42. Coloque el hardware de imagen (cámara, divisor de imagen, lente) como se muestra en la Figura 1,para centrarse en un campo de visión adecuado.NOTA: El divisor está configurado con un espejo dicroico (660+ nm) que pasa RH237 y refleja los espectros de emisión Rhod2. Los filtros de emisión de alta transmisión se utilizan para la luz emitida RH237 (paso largo de 710 nm) y Rhod2 (585 x 40 nm) (paso largo ET710, véase Tabla de materiales). Una lente de 50 mm/F0.95l de amplio alumna dotada está unida a la parte frontal del divisor de imagen. Esta configuración da como resultado una separación adecuada de la luz de emisión, como se ha validado previamente43,44. Conecte la cámara a una estación de trabajo y adquiera imágenes utilizando el software seleccionado, con un tiempo de exposición de 0,5 x 2 ms. Realice la alineación de la imagen con la ayuda de software que pueda dividir las regiones deseadas, superponery y mostrar una resta a escala de grises o pseudocolor adición para resaltar la desalineación (consulte la opción Tabla de materiales para software). Apague la luz de la habitación para minimizar la interferencia de fluorescencia de la iluminación ambiental. Pruebe las luces LED (525 nm, 1,4 mW/mm2) antes del inicio de la toma de imágenes para garantizar una iluminación epicardial uniforme y máxima, según lo determine la profundidad del pozo del sensor.NOTA: Cada luz se dirige a través de un filtro de excitación (535 x 25 nm). Las luces LED se pueden activar manualmente antes de filmar para maximizar la linealidad de la señal. La fluorescencia emitida por el epicardium se pasa a través del divisor de imágenes y los filtros de emisión. Las imágenes divididas se proyectan en un sensor de alta velocidad. El campo de visión de es de aproximadamente 12 cm x 10 cm, o 5,9 cm x 4,7 cm para cada imagen dividida, dependiendo de la elección de la lente y la distancia del corazón. Para estudios de mapeo óptico, imagen del miocardio durante el ritmo sinusal, fibrilación ventricular(Figura 4)o ritmo dinámico (S1-S1, 1-2 mA, 1 ms de ancho de pulso) a través de un electrodo de estimulación colocado en el ventrículo izquierdo(Figura 5). Comience con una longitud de ciclo de ritmo de 350 ms, y decremento de 10 a 50 ms para generar curvas de restitución(Figura 5E)35,36. 5. Limpieza Retire el corazón del sistema y drene todo lo perfundirado. Enjuague el tubo del sistema y las cámaras con agua purificada. Para el mantenimiento de rutina, enjuague periódicamente el sistema con solución detergente o una solución de peróxido de hidrógeno diluido, según sea necesario. 6. Procesamiento de datos Confirme la calidad de la señal óptica a lo largo del estudio abriendo un archivo de vídeo, seleccionando una región de interés y trazando la fluorescencia media a lo largo del tiempo utilizando un paquete de software o un algoritmo personalizado adecuado. Analizar los datos de imágenes descritos anteriormente23,33,43,45,46, para cuantificar el potencial de acción y los parámetros temporales transitorios de calcio, incluyendo el tiempo de activación, tiempo de acoplamiento de voltaje-calcio (diferencia entre los tiempos de activación de Vm y Ca), y mediciones de duración de la repolarización. Aplique umbrales para aislar píxeles epicardiales fluorescentes y descartar los datos de fondo ruidosos.NOTA: El umbral simplificará y acelerará el análisis en vídeos de gran tamaño. Filtre espacialmente las señales ópticas sobre un área de superficie epicardial con tamaños de kernel que van desde 3 mm x 3 mm hasta 5 mm x 5 mm, como se ve en la Figura 4 y la Figura 5.NOTA: Este último mejorará el SNR sin distorsionar las características potenciales de acción, morfología transitoria de calcio, o contorno general de los frentes de onda19,47. Esto puede ser innecesario si se utiliza un sensor con píxeles grandes o si se binning durante la adquisición. Filtrar señales temporalmente con un filtro digital lowpass (por ejemplo, Butterworth de 5o orden) con una frecuencia de corte entre 100 y 75 Hz para eliminar el contenido de señal insignificante45.NOTA: Vea la figura 5C para un ejemplo de los seguimientos procesados representativos. Aplique la eliminación y resta de deriva, a través del accesorio polinómico de orden N, para minimizar los efectos del fotoblanqueo, el movimiento u otras fuentes significativas de variación. Después del procesamiento y la normalización de los datos ópticos en todo un vídeo, calcule el potencial de acción y los parámetros transitorios de calcio de interés. Determinar el tiempo de activación, definido como el tiempo de derivación máxima durante la despolarización, y la fluorescencia máxima para calcular los porcentajes de repolarización y los períodos (duración potencial de acción [APD] y [Ca2+]i duración [CaD], ver Figura 5). Una vez calculados los parámetros temporales, genere mapas isocrones para representar aspectos de un solo potencial de acción o transitorio de calcio en toda la superficie epicardial con imágenes utilizando algoritmos personalizados23,33, 43,45,46.NOTA: Vea la figura 5D para un ejemplo.

Representative Results

La Figura 1A muestra un diagrama del sistema de perfusión cardíaca aislada, que incluye el circuito de tuberías, la bomba, el filtro, el oxigenador, los depósitos y los elementos de calefacción. La colocación del ECG (configuración del plomo II) y de los electrodos de ritmo se muestra en la Figura 1B,y la configuración de la imagen se representa en la Figura 1C. En la Figura 1Dse muestra un esquema de los componentes ópticos y las trayectorias de luz. Se realizaron estudios experimentales sobre corazones enteros intactos aislados de cerdos juveniles de Yorkshire (14-42 días, no 18) que oscilaron entre 2,5 y 10,5 kg de peso corporal y 18 a 137 g de peso cardíaco(Figura 2A). Después de transferir el corazón aislado a un sistema Langendorff (37 oC), la frecuencia cardíaca se estabilizó a 70 o 4,5 bpm (media de SEM) dentro de los 10 minutos de desfibrilación y se mantuvo constante durante todo el estudio(Figura 2B). Se midió un caudal medio de 184 a 17 ml/min (media de SEM), que se desaceleró a 70 x 7,5 ml/min después de perfumar con medios calentados que contenían un desacoplador mecánico(figura 2C). Los ECG de plomo II se registraron durante toda la duración del estudio durante el ritmo sinusal(Figura 3A)o en respuesta al ritmo externo(Figura 3B-E)para cuantificar los parámetros electrofisiológicos. Para la evaluación del PE, el ritmo dinámico (S1-S1) se aplicó a la aurícula derecha para identificar el WBCL y el SNRT (tiempo de recuperación después del inicio de S1-S1, Figura 3C),en el que WBCL fue denotado como el PCL más corto que inició la conducción auricular a ventricular. Se implementó un protocolo de ritmo S1-S2 utilizando un electrodo de estímulo bipolar en el ventrículo izquierdo para identificar el intervalo de acoplamiento más corto que inició la despolarización ventricular, identificando así VERP(Figura 3D). Alternativamente, un protocolo de ritmo auricular S1-S2 se aplica para señalar AVNERP (S1-S2), tal y como se muestra en del cuadro 3E. Ejemplos representativos de parámetros de electrofisiología del corazón de cerdo se alinean estrechamente con los publicados anteriormente37. Se realizaron experimentos de mapeo óptico durante el ritmo sinusal, la fibrilación ventricular espontánea(Figura 4),o durante el ritmo dinámico (S1-S1) del ventrículo izquierdo (LV) para generar curvas de restitución eléctricas y de calcio representadas en Figura 5. Las imágenes representativas de un corazón de lechón con carga de tinte se muestran en la Figura 4 con los correspondientes potenciales de acción óptica (Vm) y transitorios de calcio (Ca) recogidos de dos regiones de interés en la superficie epicardial (ventrículo derecho [RV] – azul, LV a rojo) . Las señales no procesadas se muestran durante el ritmo sinusal y durante la fibrilación ventricular. Como se mencionó anteriormente, el ritmo epicardial dinámico (S1-S1) también se utilizó durante los experimentos de mapeo óptico para normalizar cualquier ligera diferencia en la frecuencia cardíaca intrínseca(Figura 5A-E). Se muestran las señales en bruto (RV – azul, LV – rojo), que se utilizaron para representar el potencial de acción — tiempo de acoplamiento transitorio de calcio (Figura 5C), tiempo de activación y duración (Figura 5D), restitución eléctrica y de calcio (Figura 5E). Para preparaciones miocárdicas gruesas, el filtrado espacial con tamaño de núcleo de 3 mm x 3 mm es adecuado para el potencial de acción epicardial o el análisis transitorio de calcio19,47. En consecuencia, las imágenes de alta resolución espacial (en la configuración descrita 1240 x 1024 en total, o 620 x 512 por canal, tamaño de píxel de 6,5 m) a menudo se agrupan espacialmente durante o después de la adquisición(Figura 5C). El procesamiento de imágenes se puede realizar para generar mapas de activación y repolarización utilizando algoritmos personalizados23,33,43,45 (Figura 3D), con el tiempo de activación de cada píxel en el corazón se definió como la derivada máxima del potencial de acción o el golpe ascendente transitorio de calcio. Figura 1: Configuración experimental. (A) Diagrama del sistema aislado de perfusión cardíaca; las flechas denotan la dirección del flujo. (B) Se muestra un corazón canulado con colocación de electrodos. RA – Aurícula derecha, RV – ventrículo derecho, LV – ventrículo izquierdo, ECG – electrocardiograma de plomo II. (C) La plataforma de imágenes muy cerca del tejido cardíaco. (D) La emisión de cada sonda complementaria (voltaje, calcio) se separa por longitud de onda utilizando un dispositivo de división de imágenes con filtros de emisión adecuados y espejo dicroico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Mediciones del peso cardíaco, la frecuencia y el flujo. (A) Relación peso del corazón a peso corporal para cada lechón utilizado en el estudio (n x 18). (B) Frecuencia cardíaca medida 10 min después de la desfibrilación y de nuevo al final del estudio (aproximadamente 1 h). (C) El flujo coronario cae precipitadamente después de la perfusión con un desacoplador mecánico (+BDM) debido a la reducción de la demanda de oxígeno. Las barras de escala representan la media de SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Ejemplos representativos de grabaciones de electrocardiogramas de plomo II recogidas durante el ritmo sinusal o en respuesta al ritmo externo. (A) Ritmo sinusal normal. (B) Ejemplo de ritmo epicardial a una longitud de ciclo de 400 ms (S1-S1), que se utilizó para experimentos de imagen. (C) Superior: ritmo auricular para identificar WBCL; se observa una captura exitosa en S1 a 250 ms en la que se observa la conducción auricular a ventricular. Tenga en cuenta que el ritmo auricular se puede utilizar para determinar la SNRT (tiempo para la descarga del nódulo sinusal, después de iniciar el ritmo externo). Inferior: A medida que la longitud del ciclo S1 se reduce a 205 ms, la conducción al ventrículo falla. (D) Parte superior: ritmo epicardial (S1-S2) para identificar VERP; La captura exitosa se observa en S1 a 450 ms, S2 a 300 ms. Inferior: A medida que la longitud del ciclo S2 se reduce a 250 ms, el tejido ventricular no puede capturar. (E) Ritmo auricular (S1-S2) para identificar AVNERP. Arriba: La captura exitosa se observa en S1 a 450 ms, S2 a 200 ms. Inferior: A medida que la longitud del ciclo S2 se reduce a 199 ms, la conducción al ventrículo falla. Las flechas azules denotan picos de ritmo, las flechas rojas denotan captura (‘C’) o ninguna captura (‘NC’). S1-S1 – ritmo dinámico, S1-S2 – ritmo de estímulo adicional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Datos ópticos durante el ritmo sinusal y la fibrilación ventricular. Izquierda: Imágenes representativas de un corazón de cerdo cargado con tinte (Vm – voltaje, RH237; Ca á calcio, Rhod2), vista anterior. Tensión transmembrana filtrada espacialmente y señales fluorescentes de calcio intracelular de un corazón de cerdo durante el ritmo sinusal (Centro). Señales de tensión y calcio durante la fibrilación ventricular (derecha). Tamaños de región de señal (15 x 15 píxeles a 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 x 4,8 x 4,8 mm2 tamaño de núcleo) representados como cuadrados rojos y azules. Unidades: F/F. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Datos ópticos de los corazones de cerdo perfundidos por Langendorff. Tensión transmembrana sin procesar, filtrada espacialmente (A) y (B) señales de fluorescencia de calcio intracelular desde los ventrículos derecho e izquierdo durante el ritmo eléctrico en el ápice. Las señales sin filtrar y con promediado espacial representan potenciales de acción óptica y transitorios de calcio de regiones de interés (las unidades de señal son F/F). (C) Una superposición de transitorios normalizados ilustra el tiempo de acoplamiento transitorio potencial-calcio de acción (paso bajo filtrado a 75 Hz). (D) Procesamiento de señales a través de la superficie epicardial para generar mapas isocronas de parámetros temporales, incluyendo el tiempo de activación (tact)y el 80% de tiempo de repolarización. (E) Curvas de restitución transitorias eléctricas y cálcicas generadas a múltiples frecuencias (izquierda) con análisis estadísticos (derecha) para ilustrar un tiempo de repolarización más largo a longitudes de ciclo de ritmo más lentas. Barras de escala: media, SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Química Fórmula Peso molecular g/L Cloruro de sodio Nacl 58.44 5.26 Gluconato de sodio C6H11NaO7 218.14 5.02 Acetato de sodio trihidrato C2H3NaO2•3H2O 136.08 3.68 Cloruro de potasio Kcl 74.55 0.63 Cloruro de magnesio (anhidro) MgCl2 95.21 0.1405 8.4% Bicarbonato de sodio NaHCO3 84.01 13 Manitol C6H14O6 182.17 16.3 Sulfato de magnesio MgSO4 120.37 4 Ph 7.4 Osmolaridad (mOsmol/L) 294 Tabla 1: Modificación de la receta de cardioplejia de Del Nido.

Discussion

Aunque los modelos de investigación cardiovascular van desde preparaciones celulares hasta preparaciones in vivo, hay un equilibrio inherente entre la relevancia clínica y la utilidad experimental. En este espectro, el corazón aislado de Langendorff perfundido sigue siendo un compromiso útil para el estudio de la fisiología cardíaca48. Todo el modelo cardíaco representa un mayor nivel de integración funcional y estructural que las monocapas de una sola célula o tejido, pero también evita las complejidades de confunción asociadas con los modelos in vivo. Una ventaja importante durante los experimentos de mapeo óptico dual es que se puede observar la superficie epicardial del corazón aislado, y se pueden utilizar imágenes de fluorescencia del potencial transmembrana y manejo de calcio para monitorear la fisiología cardíaca34.

Los modelos de roedores se utilizan más comúnmente para preparaciones cardíacas aisladas en comparación con animales más grandes, debido en parte al costo asociado de up-dimensionar todos los elementos involucrados (por ejemplo, volumen de la solución, circuito de perfusión, cantidad de disyes y desacopladores mecánicos) junto con una mayor inestabilidad y propensión a las arritmias en animales más grandes10,36,49. Una ventaja de usar corazones de cerdo es que se asemejan mucho al corazón humano en estructura, tamaño y tasa de contracción, por lo tanto, modelando con mayor precisión parámetros hemodinámicos como el flujo sanguíneo coronario y la salida cardíaca. Del mismo modo, los seres humanos y los cerdos tienen un manejo similar del calcio, intervalos de electrocardiograma37y morfología potencial de acción, incluidos los canales subyacentes que representa12,50,51, 52. Este protocolo describe en detalle los pasos para crear un modelo animal grande reproducible para caracterizar exhaustivamente la función miocárdica. Las imágenes simultáneas de voltaje transmembrana (RH237) y calcio intracelular (Rhod2), utilizados junto con protocolos electrofisiológicos establecidos, brindan la oportunidad de identificar mecanismos que son responsables de la alteración cardíaca Función. La metodología descrita se puede utilizar para pruebas de seguridad preclínicas, pruebas toxicológicas y la investigación de patologías genéticas u otras enfermedades. Además, la metodología descrita puede ser modificada y adaptada para su uso con otros modelos cardíacos (por ejemplo, caninos, humanos) dependiendo del enfoque específico de investigación53,54,55.

Hay algunas modificaciones críticas a tener en cuenta al pasar de un modelo de roedor más pequeño a un modelo de cerdo más grande para preparaciones aisladas de corazón entero. Durante la preparación y configuración, recomendamos añadir albúmina al perfusado para mantener la presión oncótica y reducir el edema (más antiespuma, si es necesario)56,57,58,59. Por otra parte, perfusate que contiene albúmina también puede ayudar en estudios metabólicos que también requieren suplementos de ácidos grasos a los medios60,61. A diferencia de los corazones de roedores, el corazón de cerdo más grande no necesita ser sumergido en medios cálidos debido a su menor relación superficie-volumen y el aumento del volumen de medios calentados que fluyen a través de los vasos coronarios que mantiene mejor la temperatura. Como se señaló anteriormente, colocamos sondas de temperatura dentro del ventrículo derecho y en la superficie epicardial de los ventrículos derecho e izquierdo, observando sólo ligeras fluctuaciones de temperatura de 1 a 2 oC en los tres lugares a lo largo del estudio. Es importante destacar que estos caudales más rápidos también pueden aumentar la probabilidad de burbujas y una posible embolia. Para evitar este problema, recomendamos usar una trampa de burbujas con tubos de gran diámetro que conducen directamente a la cánula aórtica. Del mismo modo, nos resultó más útil tener dos individuos trabajando en tándem para canalizar la aorta en un corazón más grande (y más pesado); una persona para mantener la aorta abierta con hemostats robustos y otra para asegurar la aorta a la cátula usando cinta umbilical. En la metodología descrita, encontramos que la perfusión con cardioplejia y desfibrilación eran vitales para la recuperación cardíaca, lo que es contrario a las preparaciones para el corazón de los roedores. En nuestra experiencia, sólo unos pocos corazones extirpado reanudaron la actividad normal impulsada por los senos parano sin cardioversión.

Para mejorar los puntos finales de las imágenes ópticas, una preparación del corazón colgante limitó el efecto del deslumbramiento que puede ocurrir con un corazón sumergido. Además, el corazón colgante también evita cualquier compresión o compromiso de los vasos coronarios en el aspecto posterior del corazón que puede ocurrir al colocar el corazón horizontalmente para obtener imágenes verticales. También encontramos que la carga de colorantes fluorescentes después de la trampa de burbujas (cerca de la cánula aórtica) mejoró en gran medida la tinción de tejido y señales ópticas. Por último, para mejorar los puntos finales de la electrofisiología cardíaca, el uso de un electrodo de estimulación coaxial más grande facilitó el ritmo auricular exitoso. Aunque describimos el uso de electrocardiogramas para identificar la captura y pérdida de captura para varios parámetros EP, también se pueden utilizar catéteres intracardiacos o electrodos de registro bipolar.

Nuestro estudio se centró en el desarrollo de una metodología para la cartografía óptica dual y la evaluación electrofisiológica cardíaca en un modelo de corazón porcino aislado e intacto. Debido a las similitudes con el corazón humano juvenil, el corazón porcino sigue siendo un modelo popular para estudios centrados en cardiología pediátrica o defectos cardíacos congénitos. Es importante destacar que el enfoque descrito se puede adaptar para su uso con corazones adultos de mayor tamaño y/o diferentes especies de interés. De hecho, otros laboratorios pueden encontrar que el uso de corazones caninos o humanos (ya sea donante o enfermo) son más aplicables para su enfoque específico de investigación53,54,55. Otra limitación potencial a este estudio es el uso de un desacoplador mecánico para reducir el artefacto de movimiento durante la toma de imágenes. Blebbistatin se ha convertido en el desacoplador preferido en aplicaciones de imágenes cardíacas debido a sus efectos mínimos sobre los parámetros de ECG, periodos de activación y refractarios41,62,63. BDM es una opción menos costosa, que puede ser particularmente importante en grandes estudios en animales que requieren mayores volúmenes de perfumar y desacoplador mecánico, pero se sabe que tiene un mayor impacto en las corrientes de potasio y calcio que pueden alterar el potencial de acción morfología64,65,66,67. Si se utiliza BDM, tenga en cuenta que el acortamiento de APD aumenta la vulnerabilidad de los corazones a las arrythmias inducidas por impactos68. Por el contrario, la principal limitación al uso de blebbistatin es su fotosensibilidad y fototoxicidad, aunque formulaciones alternativas que han reducido estos efectos69,70,71. Por último, la metodología descrita utiliza un sistema de una sola cámara para la experimentación de mapeo óptico dual, pero es importante tener en cuenta que los estudios de investigación se centraron en la fibrilación ventricular y/o el seguimiento de ondas eléctricas a través de la superficie epicardial tendría que modificar este enfoque para incluir imágenes panorámicas tridimensionales, como se describe en otros15,19,72,73,74,75 .

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen con gratitud al Dr. Matthew Kay por su útil orientación experimental, y a Manelle Ramadan y Muhaymin Chowdhury por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01HL139472 a NGP, R01 HL139712 a NI), El Instituto de Investigación Infantil, el Instituto Nacional del Corazón infantil y el Instituto Sheikh Zayed para la Innovación Quirúrgica Pediátrica.

Materials

(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560-5MG Mechanical Uncoupler
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753-100G Mechanical Uncoupler
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418
Analog signal interface emka Technologies itf16USB
Antifoam Sigma-Aldrich A5758-250ML
Antifoam Y-30 Emulsion Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A5758
Aortic cannula, 5/16” Cole-Parmer 45509-60
Bubble trap Sigma-Aldrich CLS430641U-100EA
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
Camera, sCMOS Andor Technology Zyla 4.2 PLUS
Coaxial stimulation electrode (atria) Harvard Apparatus 73-0219
Defibrillator Zoll M Series
Dichroic mirror Chroma Technology T660lpxrxt-UF2
Differential amplifier Warner Instruments DP-304A
Emission filter, calcium Chroma Technology ET585/40m
Emission filter, voltage Chroma Technology ET710lp
EP stimulator (Bloom) Fisher Medical DTU-215B
Excitation filter Chroma Technology CT510/60bp
Excitation lights Thorlabs SOLIS-525C
Filter McMaster-Carr 8147K52
Filter cartridge, polypropylene Pentair PD-5-934
Filter housing McMaster-Carr 9979T21
Flow transducer Transonic ME6PXN
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968
Heating coil Radnoti 158821
Hemofilter Hemocor HPH 400
Hemostatic Forceps World Precision Instruments 501326
Image Splitter Cairn Research OptoSplit II
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Large-bore tubing, I.D. 3/8” Fisher Scientific 14-169-7H
Lens 50 mm, 0.95 f-stop Navitar DO-5095
Metamorph Molecular Devices Image Alignment
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
Mucasol detergent Sigma-Aldrich Z637181-2L
Na Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm AD Instruments Inc. MLA1204
Noise eliminator Quest Scientific Humbug
Perfusion pump PolyStan A/S 1481
Pressure transducer World Precision Instruments BLPR2
Reservoir, 2 liter Cole-Parmer UX-34541-07
RH237 AAT Bioquest Inc. 21480
Rhod2-AM AAT Bioquest Inc. 21062
Stimulation electrode (ventricle) Harvard Apparatus 73-0160
Surgical Suture McKesson Medical-Surgical 890186
Transducer amplifier World Precision Instruments TBM4M
Tubing flow console Transonic TS410
Umbilical tape Jorvet J0025UA
Water bath/circulator VWR 89400-970
Surgical Tools
Bandage shears Harvard Apparatus 72-8448 Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm
Electrocautery Dalwha Corp. Ltd. BA2ALD001 Model: 200 Basic
Hemostat Roboz RS-7476 St Vincent Tube Occluding Forceps
Hemostatic forceps Harvard Apparatus 72-8960 Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm
Hemostats Harvard Apparatus 72-8985 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm
Mayo scissors WPI 501749 14.5 cm, Straight
Metzenbaum scissors WPI 501747 11.5 cm, Straight
Mosquito forceps Harvard Apparatus 72-8980 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm
Needle holder Harvard Apparatus 72-8828 Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length
Pediatric cross clamp Roboz RS-7660 Cooley-Derra Clamp 6.25" 5mm Calibrations
Right angle forceps WPI 501240 Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle
Scalpel Ted Pella 549-4 Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades
scissors Harvard Apparatus 72-8380 Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm
Straight Serrated forceps WPI 500363 Dressing Forceps 15.5cm
Towel clamp WPI 501700 Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS
Weitlaner retractor WPI 501314 Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2×3 Sharp Prongs
Disposables
3-0 prolene suture Various vendors Various vendors
Vessel loop Aspen surgical 011001PBX Sterion® Vessel Loop, 0.8 x 406mm
Cardioplegia (Plegisol) Pfizer 00409-7969-05 Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg
Heparin Various vendors Various vendors 300 U/kg
Syringe and Needle Various vendors Various vendors 60mL & 18G respectively
Umbilical tape Ethicon U12T
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Swift, L. M., Jaimes III, R., McCullough, D., Burke, M., Reilly, M., Maeda, T., Zhang, H., Ishibashi, N., Rogers, J. M., Posnack, N. G. Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts. J. Vis. Exp. (153), e60472, doi:10.3791/60472 (2019).
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