वर्णित ब्याज और लेबल मुक्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री के दिए गए प्रोटीन के इम्यूनोफिनिटी संवर्धन का उपयोग करके परमाणु उपसे्युलर अंश से प्रोटीन इंटरैक्शन भागीदारों की पहचान करने के लिए एक प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो है। कार्यप्रवाह में उपसेलर आंशिकता, इम्यूनोप्रिसिपेटेशन, फिल्टर एडेड नमूना तैयार करना, ऑफलाइन सफाई, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और डाउनस्ट्रीम बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन शामिल है।
इम्यूनोफिनिटी शुद्धि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईपी-एमएस) प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने की एक मजबूत मात्रात्मक विधि के रूप में उभरा है। यह प्रकाशन नाभिक से कम बहुतायत प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक पूर्ण इंटरैक्शन प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो प्रस्तुत करता है जिसे अन्य उपकोशिकीडिब्बों पर भी लागू किया जा सकता है। इस कार्यप्रवाह में उपसे्युलर आक्षेप, इम्यूनोप्रिसिपेटेशन, नमूना तैयारकरना, ऑफलाइन सफाई, सिंगल-शॉट लेबल-फ्री मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और डाउनस्ट्रीम कंप्यूटेशनल एनालिसिस और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन शामिल हैं। हमारे प्रोटोकॉल को विभाजित, कम बहुतायत इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जाता है जो पूरे सेल लाइसेट्स (जैसे, नाभिक में प्रतिलेखन कारक इंटरैक्शन) से एंडोजेनस प्रोटीन के इम्यूनोप्रिप्रिमिटेशन द्वारा पहचानना मुश्किल है आंशिक उपकोशिकीय डिब्बे। यहां उल्लिखित नमूना तैयारी पाइपलाइन हेला सेल परमाणु अर्क, एंडोजेनस चारा प्रोटीन की इम्यूनोफिनिटी शुद्धि, और मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की तैयारी के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करती है। हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित इंटरैक्शन प्रोफाइलिंग प्रयोगों में बड़े पैमाने पर इम्यूनोप्रिसिप्रिशन करने के लिए पद्धतिगत विचारों पर भी चर्चा करते हैं और सच्चे सकारात्मक प्रोटीन को अलग करने के लिए डेटा गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं गैर-विशिष्ट बातचीत से बातचीत। इस दृष्टिकोण को यहां सीएमजीसी काइनेस, DYRK1A, नाभिक के भीतर खराब परिभाषित बातचीत के साथ एक कम बहुतायत प्रोटीन kinase के परमाणु बातचीत की जांच करके प्रदर्शित किया जाता है ।
मानव प्रोटेम स्थिर बहुउपइकाई परिसरों और क्षणिक प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के गठन के माध्यम से विशाल संरचनात्मक और जैव रासायनिक विविधता प्रदर्शित करता है। तदनुसार, आणविक तंत्र को जानने के लिए जांच में ब्याज के प्रोटीन के लिए इंटरैक्शन पार्टनर्स की पहचान आमतौर पर जरूरी होती है । आत्मीयता शुद्धिकरण प्रोटोकॉल में हाल ही में प्रगति और उच्च संकल्प तेजी से स्कैनिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री इंस्ट्रूमेंटेशन के आगमन ने एक ही निष्पक्ष प्रयोग में प्रोटीन इंटरैक्शन परिदृश्य की आसान मैपिंग को सक्षम किया है।
प्रोटीन इंटरैक्शन प्रोटोकॉल आमतौर पर एक्टोपिक एक्सप्रेशन सिस्टम को एफ़िनिटी-टैग किए गए फ्यूजन के साथ काम करते हैं, जो उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की आवश्यकता के बिना प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए बनाए जाते हैं, जो ब्याज के प्रोटीन को पहचानते हैं1,2। हालांकि, एपिटोप टैग-आधारित तरीकों में कई कमियां हैं। एपिटोप के साथ शारीरिक बातचीत से गैर विशिष्ट संवादेने वाले प्रोटीन का पता लगाया जा सकता है3. इसके अतिरिक्त, प्रोटीन के एन-या सी-टर्मिनल के लिए इन एपिटोप टैग का संलयन देशी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को अवरुद्ध कर सकता है, या गैर-शारीरिक संरचनाओं को बढ़ावा देने के लिए प्रोटीन तह को बाधित कर सकता है4। इसके अलावा, एक्टोपिक अभिव्यक्ति प्रणाली आमतौर पर सुप्राफिजिकल सांद्रता पर चारा प्रोटीन को ओवरएक्सप्रेस करती है, जिसके परिणामस्वरूप विशेष रूप से खुराक-संवेदनशील जीन5के लिए आर्टितथ्यात्मक प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान हो सकती है। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, एंडोजेनस चारा प्रोटीन को संबंधित बातचीत शिकार प्रोटीन के साथ इम्यूनोप्रीप्रिटिमिट किया जा सकता है, जो देशी प्रोटीन को पहचानता है कि एक उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की उपलब्धता को मानते हुए।
बशर्ते यहां एक उदाहरण के रूप में CMGC प्रोटीन kinase DYRK1A का उपयोग कर एक अंतर्जात प्रोटीन के परमाणु इंटरैक्प्रोम का पता लगाने के लिए एक बातचीत प्रोटेओमिक्स कार्यप्रवाह है । DYRK1A कॉपी नंबर, गतिविधि स्तर, या अभिव्यक्ति के व्यवधान मनुष्यों में गंभीर बौद्धिक विकलांगता पैदा कर सकता है, औरचूहों6,7,8,9में भ्रूण घातकता । DYRK1A गतिशील स्थानिक विनियमन10,और विभाजित प्रोटीन इंटरैक्शन11,12को प्रदर्शित करता है, जिसमें विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों के लिए विशिष्ट कम बहुतायत इंटरैक्शन पार्टनर्स का पता लगाने में सक्षम दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।
यह प्रोटोकॉल मानव वाला कोशिकाओं के सेलुलर अंश को साइटोसोल और न्यूक्लियोप्लाज्म अंशों, इम्यूनोप्रिसिप्रिशन, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयार करने और डेटा की गुणवत्ता के मूल्यांकन और परिणामों की कल्पना के लिए बायोइन्फॉर्मेटिक पाइपलाइन का अवलोकन करता है, जिसमें विश्लेषण और दृश्य(चित्रा 1)के लिए प्रदान की गई आर लिपियों केसाथ। इस कार्यप्रवाह में उपयोग किए जाने वाले प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर पैकेज डाउनलोड के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं या वेब इंटरफेस के माध्यम से पहुँचा जा सकता है। सॉफ्टवेयर और कम्प्यूटेशनल विधियों के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिए, प्रदान किए गए लिंक पर गहन ट्यूटोरियल और अनुदेश उपलब्ध हैं।
यहां उल्लिखित प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो ब्याज के प्रोटीन के लिए उच्च आत्मविश्वास वाले प्रोटीन इंटरएक्टर्स की पहचान करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण उपसेलुलर अंश के माध्यम से नमूना जटिलता को कम करता है और मजबूत नमूना तैयारी, ऑफलाइन नमूना साफ, और एलसी-एमएस प्रणाली के कड़े गुणवत्ता नियंत्रण के माध्यम से पहचान इंटरैक्शन भागीदारों को बढ़ाने पर केंद्रित है। यहां वर्णित डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण चारा के साथ copurifying के रूप में पहचाने गए प्रोटीन के सरल सांख्यिकीय मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । हालांकि, प्रायोगिक चर (पैमाने, सेल लाइन, एंटीबॉडी विकल्प) की एक उच्च संख्या के कारण, प्रत्येक प्रयोग डेटा दृश्य और संवर्धन के बारे में विभिन्न कटऑफ और विचारों की आवश्यकता होती है।
आईपी-एमएस प्रयोग में पहला डिजाइन विचार एंटीबॉडी का चयन है जिसका उपयोग इसके बातचीत भागीदारों के साथ ब्याज के प्रोटीन के सहशुद्धि के लिए किया जाएगा। जबकि वाणिज्यिक एंटीबॉडी की उपलब्धता पिछले कई दशकों में मानव प्रोटेम के बड़े हिस्से को कवर करने के लिए विस्तारित किया गया है, वहां अभी भी कई प्रोटीन है जिसके लिए अभिकर्मकों सीमित हैं । इसके अलावा, पश्चिमी दाग का पता लगाने जैसे अनुप्रयोगों के लिए मान्य किए गए एंटीबॉडी इम्यूनोप्रिसिप्रिशन प्रयोग में लक्ष्य प्रोटीन के चयनात्मक संवर्धन में असमर्थ हो सकते हैं। बड़े पैमाने पर इंटरैक्शन प्रोटेओमिक्स प्रयोग करने से पहले, 90% समप्रवाह 10 सेमी पकवान, या समकक्ष सेल नंबर से आईपी को पूरा करने और पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा ब्याज के लक्षित प्रोटीन की जांच करने का सुझाव दिया जाता है। यदि इम्यूनोप्रिसिप्रिशन के लिए एक से अधिक एंटीबॉडी उपलब्ध है, तो इसके अतिरिक्त प्रोटीन के विभिन्न भागों के भीतर एपिटोप को पहचानने वाले कई एंटीबॉडी का चयन करने का सुझाव दिया जाता है। चारा प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी की बाध्यकारी ख्यात बातचीत भागीदारों के लिए आवश्यक बाध्यकारी इंटरफ़ेस को कम कर सकती है। चारा प्रोटीन के लिए एक माध्यमिक एपिटोप का चयन एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रयोग द्वारा पहचाने गए इंटरैक्शन प्रोफाइल के कवरेज में वृद्धि करेगा।
एक दूसरा प्रमुख विचार चारा के साथ copurifying के रूप में पहचान के रूप में पहचान उन लोगों से कम आत्मविश्वास या गैर विशिष्ट बातचीत से उच्च विश्वास बातचीत भेद के लिए उचित नियंत्रण के चयन में निहित है । आईपी-एमएस प्रयोग के लिए सबसे कठोर नियंत्रण चारा की CRISPR KO सेल लाइन से इम्यूनोप्रिसिप्रिशन को पूरा करना है। इस तरह के नियंत्रण की पहचान और गैर विशिष्ट प्रोटीन है कि सीधे एंटीबॉडी के बजाय चारा प्रोटीन के लिए बाध्य से बाहर छानने में सक्षम बनाता है । ऐसे मामलों में जहां प्रत्येक चारा प्रोटीन की CRISPR KO सेल लाइन उत्पन्न करना संभव नहीं है, चारा एंटीबॉडी के समान आइसोटाइप का आईजीजी-बीड नियंत्रण उपयोग किया जा सकता है। कई प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करने वाले एंटीबॉडी के एक पैनल को नियोजित करने वाले प्रयोगों में, मोतियों का उपयोग केवल नियंत्रण उचित हो सकता है लेकिन उच्च आत्मविश्वास इंटरएक्टर्स के रूप में पहचाने गए झूठे सकारात्मक की दर में वृद्धि करेगा।
आईपी-एमएस प्रयोग में उपयोग की जाने वाली सेल लाइन का चयन कई प्रमुख कारकों पर निर्भर करता है। प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण काफी हद तक सेल प्रकार पर निर्भर हैं। जबकि आरएनए अभिव्यक्ति का अनुमान कई आमतौर पर इस्तेमाल सेल लाइनों में सबसे जीन के लिए पाया जा सकता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति खराब आरएनए अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध है और प्रयोगात्मक25निर्धारित किया जाना चाहिए । सेल लाइनों जिसमें एक चारा प्रोटीन बहुत कम प्रतिलिपि संख्या में व्यक्त किया जाता है सेल संस्कृति पैमाने में भारी वृद्धि के साथ जुड़े समस्याओं को दरकिनार करने के लिए बचा जाना चाहिए कि आवश्यक हो सकता है । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नमूना तैयारी को बहुत कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। फिल्टर एडेड नमूना तैयारी (FASP) विधि, जबकि मजबूत, एक नमूने में पेप्टाइड के 50% से अधिक नुकसान का कारण बन सकता है। एकल-पॉट ठोस चरण-बढ़ाया नमूना तैयारी (SP3) बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए नमूने पैदा करने का एक कुशल तरीका है जो नमूना हानि26को कम करता है। नमूना तैयारी की SP3 विधि द्वारा सक्षम बढ़ी हुई वसूली पता लगाने की सीमा के पास आने वाले प्रोटीन के परिमाणीकरण के लिए इस कार्यप्रवाह में एक उपयोगी विकल्प हो सकती है।
इस प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो को कई परमाणु बाइट्स में लागू किया गया है, जिसमें किनेस, ई 3 सर्वव्यापी लिगैस, और मल्टीसबयूनिट परिसरों के मचान सदस्य शामिल हैं। एंटीबॉडी अभिकर्मकों के उचित सत्यापन को मानते हुए, इस कार्यप्रवाह के सफल निष्पादन के परिणामस्वरूप ब्याज के प्रोटीन के लिए उच्च आत्मविश्वास वाले प्रोटीन परमाणु संपर्क भागीदारों का पता लगाया जाएगा।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को लिंडा क्रैनिक इंस्टीट्यूट फॉर डाउन सिंड्रोम से डब्ल्यूएमओ को एक ग्रैंड चैलेंज ग्रांट द्वारा और एक DARPA सहकारी समझौते 13-34-आरटीए-FP-007 द्वारा समर्थित किया गया था । हम पांडुलिपि को पढ़ने और टिप्पणी करने में उनके योगदान के लिए जेसी कुर्लैंड और किरा कोज़ोनोलिनो का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561096 | |
acetone (HPLC) | Thermo Fisher Scientific | A949SK-4 | |
Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column | Millipore Sigma | UFC503096 | |
Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | |
benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
Dialysis tubing closure | Caroline Biological Supply Company | 684239 | |
DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47724 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 887845 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
HeLa QC tryptic digest | Pierce | 88329 | |
HEPES | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
KONTES Dounce homogenizer 7 ml | VWR | KT885300-0007 | |
Large Clearance pestle 7ml | VWR | KT885301-0007 | |
Lysyl endopeptidase C | VWR | 125-05061 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
Microcystin | enzo life sciences | ALX-350-012-C100 | |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma-Aldrich | 98379 | |
p84 antibody | GeneTex | GTX70220 | |
Phosphate Buffered Saline | |||
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Pierce BSA Protein Digest, MS grade | Thermo Fisher Scientific | 88341 | LCMS QC |
Pierce C18 spin columns | Thermo Fisher Scientific | PI-89873 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | For mass spectrometry sample prep |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0780-01 | |
Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0618-01 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Silica emitter tip | Pico TIP | FS360-20-10 | |
Small Clearance pestle 7ml | VWR | KT885302-0007 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | |
Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing | Thomas Scientific | 3787K17 | |
TC Dish 150, Standard | Sarstedt | 83.3903 | Tissue culture dish for adherent cells |
TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
TCEP | Thermo Scientific | PG82080 | |
TFA | Thermo Fisher Scientific | 28904 | |
Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS | Thermo Fisher Scientific | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
Urea | Thermo Fisher Scientific | 29700 | |
Waters ACQUITY M-Class UPLC | Waters | ||
Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) | Waters | 186007484 | nanoflow C18 column |