Detta protokoll syftar till att beskriva steg-för-steg tekniken för extraktion och bedömning av hjärt funktion med hjälp av flådda kardiomyocyter. Denna metodik möjliggör mätning och akutmodulering av myofilamentfunktion med hjälp av små frysta tarmbiopsier som kan samlas in från olika hjärtplatser, från möss till män.
I denna artikel beskriver vi de steg som krävs för att isolera en enda permeabilized (“flådd”) kardiomyocyte och bifoga den till en kraft-mätning apparat och en motor för att utföra funktionella studier. Dessa studier kommer att möjliggöra mätning av kardiomycytstelhet (passiv kraft) och dess aktivering med olika kalcium (Ca2+)-innehållande lösningar för att bestämma, bland annat: maximal kraftutveckling, myofilament Ca2+-sensitivitet (pCa50), cooperativity (nHill) och kraftombyggnadshastigheten (ktr). Denna metod möjliggör också bestämning av effekterna av läkemedel som agerar direkt på myofilaments och av uttryck av exogena rekombinanta proteiner på både aktiva och passiva egenskaper av kardiomyocyter. Kliniskt, flådda kardiomyocyte studier belysa patofysiologi av många hjärtinfarkt sjukdomar och tillåta in vitro-bedömning av effekterna av terapeutiska interventioner som riktar sig till myofilaments. Sammantaget möjliggör denna teknik ett förtydligande av hjärt patofysiologi genom att undersöka samband mellan in vitro- och in vivo-parametrar i djurmodeller och mänsklig vävnad som erhållits under öppen hjärt- eller transplantationskirurgi.
Traditionellt har bedömning av myokardiska mekaniska egenskaper gjorts mest i flercelliga preparat, såsom papillära muskler och trabeculae1,2. Flercelliga hjärtmuskler remsor inkluderar en heterogen population av celler, inklusive kontraktil kardiomyocyter med ett okänt mönster av orientering och kraftgenerering, elektrisk aktivitet och spänning/töjningsfördelningar samt en omgivande bindvävsmatris3,4. En beredning utan kollagen och som innehåller en enda kardiomyocyte skulle möjliggöra mätning av sarkomere längd och korsbro kontraktila egenskaper i en mycket exakt och kontrollerat sätt5,6. Därför, under de senaste fyra decennierna, flera metoder har utvecklats möjliggör undersöka mekaniska, kontraktil, och avkoppling egenskaper av en enda kardiomyocyte6,7. De kontraktila funktion av dessa celler är starkt beroende av sarkomere längd och cross-bridge cykling kinetik3. Det är således önskvärt att undersöka muskelfunktion direkt i enstaka isolerade hjärtceller, med tanke på att det tillåter att bedöma sarcomere längd och prestanda samt korsbrofunktion och kontraktila egenskaper. Att isolera och fästa funktionella kardiomyocyter med en rimlig optisk sarkomereupplösning medan kraftmätningen registreras på μN-nivå är dock fortfarande utmanandeoch utvecklas 3,6. Andra utmaningar är logistiken som behöver installeras för att isolera kardiomyocyter från nyhämtade biopsier. Oförutsägbarheten hos mänskliga biopsier insamling, till exempel, kan äventyra genomförbarheten av experimenten.
Dessutom har etiska farhågor avseende ersättning, minskning och förfining av djurförsök för vetenskapliga förfaranden (principerna för 3Rs) främjat studieförändringar på cell- och vävnadsnivå, helst i mänskliga biopsier, eller i mindre djurprover. I självaste en progressiv förfining av metoder för att bedöma hjärtfunktion in vitro på en mindre nivå av komplexitet möjliggör korrekt integration av resultaten till hela kroppen och översätta dem till det kliniskascenariot 7. Sammantaget, med hjälp av prover som lagras vid -80 °C för att extrahera kardiomyocyter kan vara ett tilltalande alternativ.
Den myokardiska vävnaden skärs i små bitar och homogeniseras med en mortel och en mortel. Resultatet av denna homogenisering är en suspension av flådda buntade och isolerade celler med varierande grad av sarcolemmal skada, vari näroplasmen utsätts för badmediet och alla de cellulära komponenterna tvättas ut. Strukturer som myofibrilerna som är längre bort från sarcolemma bevaras. Således hålls sarkomere förkortning och funktionella egenskaper i samband med den myofibrillar apparaten intakt och kan registreras8,9.
Kardiomyocytekraftens kraftmätningssystem består av en elektromagnetisk motor, som används för att justera kardiomyocytelängd, och en kraftgivare, som mäter isometrisk kardiomyocytekontraktion. En permeabiliserad, eller flådd, kardiomyocyte placeras i en experimentkammare som innehåller en avslappnande lösning ([Ca2+] < 10 nM) och kisellimmad på 2 tunna nålar: en fäst på motorn och den andra till kraftgivaren. Ett optiskt system används för att bestämma kardiomyocyte morfologi och sarcomere längd. Försöksprotokollet består ofta av en serie kraftupptagningar vid buffertlösningar som innehåller olika Ca2+-koncentrationer, bestämning av actin-myosin korsbrokinetik och mätning av den passiva spänningen hos de monterade kardiomyocyterna vid fördefinierade sarkomeriska längder (figur 1). Isolering av permeabiliserade kardiomyocyter från myokardprover frysta i flytande kväve (och därefter lagrad vid -80 °C) är en teknik som utnyttjar cellulär mekanik ochproteinbiokemi för mätning av maximal Ca2+-aktiverad (aktiv) kraft per tvärsnittsyta (T aktiv , kN∙m-2), Ca2+-oberoende (passiv) spänning (Tpassiv, kN∙m-2), myofilaments Ca2+-känslighet (pCa50), myofilaments cooperativity (nHill), hastigheten av kraft ombyggnad (ktr) samt sarcomere längd beroenden av Taktiv, Tpassiv, pCa50, nHill och ktr.
Målet med detta protokoll är att illustrera och sammanfatta potentialen i cardiomyocyte kraft mätning systemet som en tillförlitlig procedur för att bedöma funktionella mekaniska egenskaper av enstaka flådda kardiomyocyter isolerade från frysta prover från olika arter.
In vitro-bedömning av hjärtfunktionen med hjälp av flådda kardiomyocyter representerar en viktig teknik för att klargöra de ändringar som sker på kardiomyocyte nivå i fysiologiska (t.ex., stretch) och patologiska sammanhang (t.ex., ischemi). Denna metod har flera fördelar såsom att kräva en minimal mängd av myokardium för att bedöma funktion i kardiomyocyter som erhållits från upptinade prover; med hjälp av kardiomyocyter från ett brett spektrum av arter (möss13, råtta1,14,15,kanin 16, gris17, hund18, marsvin19 och mänskliga20) och olika hjärt platser, inklusive atria, vänster och höger ventriklar eller en specifik region i infarcted hjärtat. Dessutom tillåter denna teknik att leverera specifika koncentrationer av Ca2 + och energi (ATP) samtidigt som man mäter funktionen av reglerande och kontraktila strukturer i deras inhemska konfiguration.
Trots enkelheten i denna teknik, det finns några kritiska steg. Det är väsentligt att garantera kvaliteten på varje steg från början, inklusive provsamling. Myofilamentproteiner är mottagliga för proteaser21. Således är det obligatoriskt att lagra prover i flytande kväve omedelbart efter dess insamling. Färska prover, som inte tidigare frystes, kommer att utveckla betydligt högre krafter, så det är inte lämpligt att blanda mätning som görs i färska och frysta prover i samma protokoll. Det näst mest kritiska steget är kardiomyocyternas extraktion. Under detta förfarande är det avgörande att behålla provet på is för det mesta. En proteashämmare cocktail kan användas för att minska risken för proteinnedbrytning under extraktionen/permeabiliseringen22. För det tredje bör prover skäras i mindre bitar med hjälp av exakta skalpell rörelser sedan vi noterade minskad kvalitet kardiomyocyter när detta steg ignorerades. Ett annat kritiskt steg är att tvätta kardiomyocyterna eftersom det är svårt att ha rätt balans mellan att tvätta ut Triton (genomsyrar cellen men främjar dess ungluing) och att hålla så många celler i supernatanten som möjligt. Det är viktigt att först prova extraktionen och antalet washouts för varje prov, art eller protokoll. Till exempel, i våra händer, noterade vi att ZSF1 feta råtta vävnad extraktioner har en “fet” aspekt, vilket gjorde dessa celler mer hala under limning men inte svårare att mäta. Det sätt vi kringgå detta problem var genom att utföra fler experiment för att ha ett rimligt antal celler per djur. Dessutom är det avgörande att välja en bra cell att limma, nämligen med god stritriation och rimlig längd. Om kardiomyocyte inte har dessa funktioner, kommer det att lossna mestadels från nålen tips eller utveckla ingen / låg kraft. Det är också viktigt att använda rätt lim för kardiomyocyte fastsättning, med tanke på tiden för limning och dess effekt att limma cellen till nålen. I våra händer botar silikonlimmet (Table of Materials) snabb (10-15 min) och tillräckligt stark. Slutligen är det sista kritiska steget relaterat med att försiktigt lyfta kardiomyocyten 5 min efter limning av cellen (för att undvika limning av cellen till täcket) och innan du flyttar den till brunnarna (för att undvika att cellen ska dras av mikroskopet skede). Tabell 7 sammanfattar felsökningen som är kopplad till den här tekniken, dess bakomliggande orsaker och möjliga lösningar för att övervinna frekventa problem.
Den stora begränsningen av denna metod är att den inte kan svara på alla frågor som rör myofilament kontraktilitet, till exempel hur snabbt myofilaments aktivera / deaktivera. I in vivo inställningen, membran depolarisation, intracellulära Ca2 + öka och dess diffusion till myofilaments måste uppstå för myocyterna att kontrakt, medan i flådda kardiomyocyter Ca2 + diffusion till myofilaments sker omedelbart när cellen är nedsänkt i Ca2 + lösning. Denna snabbare hastighet av Ca2 + diffusion kommer bias myofilaments aktivering / avaktivering analys23.
Dessa experiment påverkas av olika faktorer, inklusive temperatur, lösning pH, mekanisk perturbation (slack-re-stretch vs. slack) och cellens fästprocedurer (stiftslip vs. lim), alla dessa variabler som står för litteraturavvikelser i termer av ktr och den sarkomeriska längdberoende ökningen av kraft4,12.
Framtida framsteg av tekniken inkluderar utför funktionella studier i intakt snarare än permeabilized kardiomyocyter. Denna teknik har nackdelen att förlita sig på kardiomyocyter nyligen isolerade (inte tidigare frysta). En annan viktig fråga som inte har direkt samband med denna metod, men som kan ha en betydande inverkan på den är relaterad till den maximala perioden av provfryst lagring. Specifikt är det obligatoriskt att fastställa graden av myofilament nedbrytning under hela lagringstiden (dvs. för hur länge frysta prover kan lagras för att säkerställa god kvalitet funktionella data som härrör från de extraherade kardiomyocyter).
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Portugisiska stiftelsen för vetenskap och teknik (FCT), Europeiska unionen, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) och Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) för finansiering unic (UID/IC/00051/2013) forskningsenhet. Detta projekt stöds av FEDER genom COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), projektet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), med stöd av Norte Portugals regionala operativa program (NORTE 2020), inom ramen för Portugals 2020-partnerskapsavtal, genom Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF), projektet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), med stöd av europeiska struktur- och investeringsfonder, Lissabons regionala operativa program 2020. Patrícia Rodrigues finansierades av FCT (SFRH/BD/96026/2013) och João Almeida-Coelho var av Universidade do Porto/FMUP och FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Acetone | Sigma | 34580 | |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
Imidazole | VWR | 24720.157 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
Length Controller ( Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
Inverted Microscope (IX51) | Olympus |