Denne protokollen tar sikte på å beskrive trinnvis teknikk for utvinning og vurdering av hjertefunksjon ved hjelp av skinned kardiomyocytter. Denne metodikken tillater måling og akuttmodulering av myofilamentfunksjon ved hjelp av små frosne biopsier som kan samles inn fra forskjellige hjertesteder, fra mus til menn.
I denne artikkelen beskriver vi trinnene som kreves for å isolere en enkelt permeabilisert (“skinned”) kardiomyocytt og feste den til et kraftmåleapparat og en motor for å utføre funksjonelle studier. Disse studiene vil tillate måling av kardiomyocyttstivhet (passiv kraft) og aktivering med forskjellige kalsium (Ca2 +)-inneholdende løsninger for å bestemme blant annet: maksimal kraftutvikling, myofilament Ca2 +følsomhet (pCa50),cooperativity (nHill) og frekvensen av kraftutvikling (ktr). Denne metoden muliggjør også bestemmelse av effekten av legemidler som virker direkte på myofilaments og av uttrykket av eksogene rekombinante proteiner på både aktive og passive egenskaper av kardiomyocytter. Klinisk, skinned kardiomyocytt studier fremheve patofysiologi av mange myokardsykdommer og tillate in vitro vurdering av virkningen av terapeutiske intervensjoner rettet mot myofilaments. Til sammen muliggjør denne teknikken avklaring av hjerteveiofysiologi ved å undersøke sammenhenger mellom in vitro og in vivo parametere i dyremodeller og menneskelig vev oppnådd under åpent hjerte eller transplantasjon kirurgi.
Tradisjonelt har vurdering av myokardiske egenskaper blitt forsøkt hovedsakelig i flercellede preparater, som papillære muskler og trabeculae1,2. Flercellede hjertemuskler strimler inkluderer en heterogen populasjon av celler, inkludert kontraktile kardiomyocytter med et ukjent mønster av orientering og kraftgenerering, elektrisk aktivitet og stress / belastning distribusjoner samt en omkringliggende bindevev matrise3,4. Et preparat uten kollagen og inneholder en enkelt kardiomyocyte ville tillate måling av sarcomere lengde og kryssbro kontraktile egenskaper på en svært presis og kontrollertmåte 5,6. Derfor, i løpet av de siste fire tiårene, ble det utviklet flere metoder slik at det å undersøke de mekaniske, kontraktile og avslapningsegenskapene til en enkelt kardiomyocyte6,7. Den kontraktile funksjonen til disse cellene er sterkt avhengig av sarcomere lengde og cross-bridge sykling kinetikk3. Dermed er det ønskelig å undersøke muskelfunksjon direkte i enkelt isolerte hjerteceller, med tanke på at det gjør det mulig å vurdere sarkomerlengde og ytelse, samt cross-bridge funksjon og kontraktile egenskaper. Imidlertid er det fortsatt utfordrende å isolere og feste funksjonelle kardiomyocytter med en rimelig optisk sarkomeroppløsning mens du registrerer kraftmåling på μN-nivå, ogutvikler seg 3,6. Andre utfordringer er logistikken som må installeres for å isolere kardiomyocytter fra nysamlede biopsier. Uforutsigbarheten til menneskelig biopsisamling, for eksempel, kan sette gjennomførbarheten av eksperimentene i fare.
Videre har etiske bekymringer om erstatning, reduksjon og raffinement av dyreeksperimentering for vitenskapelige prosedyrer (prinsipper for 3Rs) fremmet studieendringer på celle- og vevsnivå, helst i menneskelige biopsier, eller i mindre dyreprøver. Faktisk en progressiv raffinement av metoder for å vurdere hjertefunksjon in vitro på et mindre nivå av kompleksitet tillater riktig integrering av resultatene til hele kroppen og oversette dem til det kliniske scenariet7. Til sammen kan bruk av prøver lagret ved -80 °C for å trekke ut kardiomyocytter være et tiltalende alternativ.
Myokardvevet er skåret i små biter og homogenisert med en mørtel og en pestle. Resultatet av denne homogeniseringen er en suspensjon av skinned buntet og isolerte celler med varierende grad av sarkolemmal skade, karakterisert ved at myoplasma er utsatt for bademediet og alle cellulære komponenter vaskes ut. Strukturer som myofibrillene som er lenger unna sarcolemma, bevares. Dermed holdes sarcomere forkortende og funksjonelle egenskaper knyttet til myofibrillarapparatet intakt og kan registreres8,9.
Kardiomyocyte kraftmålingssystemet består av en elektromagnetisk motor, som brukes til å justere kardiomyocyttlengde, og en krafttransduser, som måler isometrisk kardiomyocyttkontroksjon. En permeabilisert, eller flådd, kardiomyocytt er plassert i et eksperimentelt kammer som inneholder en avslappende løsning ([Ca2+] < 10 nM) og silisiumlimt til 2 tynne nåler: en festet til motoren og den andre til krafttransduseren. Et optisk system brukes til å bestemme kardiomyocyte morfologi og sarcomere lengde. Den eksperimentelle protokollen består ofte av en rekke kraftopptak på bufferløsninger som inneholder forskjellige Ca2 + konsentrasjoner, bestemmelse av actin-myosin cross-bridge kinetikk og måling av passiv spenning av de monterte kardiomyocytter på forhåndsdefinerte sarkomer lengder (figur 1). Isolering av permeabiliserte kardiomyocytter fra myokardprøver frosset i flytende nitrogen (og deretter lagret ved -80 °C) er en teknikk som benytter cellulær mekanikk og proteinbiokjemi for måling av maksimal Ca2+-aktivert (aktiv) kraft per tverrsnittsområde (Taktiv,kN∙m-2),Ca2+-uavhengig (passiv) spenning (Tpassiv,kN∙m-2),myofilaments Ca2 +-følsomhet (pCa50),myofilaments cooperativity (nHill), frekvensen av force redevelopment (ktr) samt sarcomere lengde avhengigheter av Taktiv,Tpassiv,pCa50,nHill og ktr.
Målet med denne protokollen er å illustrere og oppsummere potensialet i kardiomyocyte kraftmålingssystemet som en pålitelig prosedyre for å vurdere de funksjonelle mekaniske egenskapene til enkelthudede kardiomyocytter isolert fra frosne prøver fra forskjellige arter.
In vitro vurdering av hjertefunksjon ved hjelp av skinned kardiomyocytter representerer en viktig teknikk for å avklare endringene som skjer på kardiomyocyttnivå i fysiologisk (f.eks. strekk) og patologisk kontekst (f.eks. iskemi). Denne metodikken har flere fordeler som å kreve en minimal mengde myokardi for å vurdere funksjon i kardiomyocytter hentet fra tinte prøver; ved hjelp av kardiomyocytter fra et bredt spekter av arter (mus13,rotte1,14,15,kanin 16,gris17,hund18,marsvin19 og menneskelig20)og forskjellige hjertesteder, inkludert atria, venstre og høyre ventrikler eller en bestemt region av det ufarde hjertet. Videre gjør denne teknikken det mulig å levere spesifikke konsentrasjoner av Ca2 + og energi (ATP) mens du måler funksjonen til regulatoriske og kontraktile strukturer i sin opprinnelige konfigurasjon.
Til tross for enkelheten i denne teknikken, er det noen kritiske skritt. Det er viktig å garantere kvaliteten på hvert trinn fra begynnelsen, inkludert prøvesamling. Myofilament proteiner er utsatt for proteaser21. Dermed er det obligatorisk å lagre prøver i flytende nitrogen umiddelbart etter innsamlingen. Ferske prøver, som ikke tidligere var frosset, vil utvikle betydelig høyere krefter, så det er ikke tilrådelig å blande måling gjort i ferske og frosne prøver i samme protokoll. Det nest mest kritiske trinnet er kardiomyocytes utvinning. Under denne prosedyren er det avgjørende å opprettholde prøven på is mesteparten av tiden. En proteasehemmercocktail kan brukes til å redusere risikoen for proteinnedbrytning under ekstraksjon/permeabilisering22. For det tredje bør prøver kuttes i mindre biter ved hjelp av presise skalpellbevegelser siden vi noterte redusert kvalitet kardiomyocytter da dette trinnet ble ignorert. Et annet kritisk skritt er å vaske kardiomyocytter siden det er vanskelig å ha den rette balansen mellom å vaske ut Triton (gjennomsyrer cellen, men fremmer sin ungluing) og holder så mange celler i det supernatante som mulig. Det er viktig å først prøve ekstraksjon og antall utvaskinger for hver prøve, arter eller protokoll. For eksempel, i våre hender, bemerket vi at ZSF1 overvektige rottevevsutvinninger har et “fett” aspekt, noe som gjorde disse cellene mer glatte under limingen, men ikke vanskeligere å måle. Måten vi omgår dette problemet var ved å utføre flere eksperimenter for å ha et rimelig antall celler per dyr. Videre er det avgjørende å velge en god celle å lime, nemlig med god striasjon og rimelig lengde. Hvis kardiomyocytten ikke har disse funksjonene, vil den for det meste løsne fra nålespissene eller utvikle ingen / lav kraft. Det er også viktig å bruke riktig lim for kardiomyocytttilbehør, med tanke på tidspunktet for liming og dens effekt for å lime cellen til nålen. I våre hender, silikon lim (Table of Materials) kurerer raskt (10-15 min) og sterk nok. Til slutt er det siste kritiske trinnet forbundet med forsiktig løfting av kardiomyocytten 5 min etter liming av cellen (for å unngå å lime cellen til dekkslipsen) og før du flytter den til brønnene (for å unngå at cellen dras av mikroskopstadiet). Tabell 7 oppsummerer feilsøkingen knyttet til denne teknikken, dens underliggende årsaker og mulige løsninger for å overvinne hyppige problemer.
Den store begrensningen av denne metoden er at den ikke kan svare på alle spørsmålene knyttet til myofilament kontraktilitet, for eksempel hvor fort myofilaments aktivere / deaktivere. I in vivo-innstillingen må membrandepolarisering, intracellulær Ca2 + økning og dens diffusjon til myofilamenter skje for at myocytter skal trekke seg sammen, mens i skinned kardiomyocytter Ca2 + diffusjon til myofilaments oppstår umiddelbart når cellen er nedsenket i Ca2 + oppløsning. Denne raskere frekvensen av Ca2 + diffusjon vil skjevhet myofilaments aktivering / deaktivering analyse23.
Disse eksperimentene påvirkes av ulike faktorer, inkludert temperatur, løsning pH, mekanisk perturbasjon (slakk-re-stretch vs slakk) og celle vedlegg prosedyrer (pin tie vs lim), alle disse variablene står for litteratur avvik i form av ktr og sarcomere lengdeavhengig økning i kraft4,12.
Fremtidig fremgang av teknikken inkluderer å utføre funksjonelle studier i intakt i stedet for permeabiliserte kardiomyocytter. Denne teknikken har ulempen med å stole på kardiomyocytter nyisolert (ikke tidligere frosset). Et annet viktig problem som ikke er direkte relatert til denne metodikken, men det kan ha betydelig innvirkning på det er relatert til den maksimale perioden med prøvefrosset lagring. Spesielt er det obligatorisk å fastslå graden av myofilament nedbrytning gjennom lagringstiden (det vil si hvor lenge frosne prøver kan lagres for å sikre god kvalitet funksjonelle data avledet fra de ekstraherte kardiomyocytter).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT), EU, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) og Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) for finansiering av UnIC (UID/IC/00051/2013) forskningsenhet. Dette prosjektet støttes av FEDER gjennom COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), prosjektet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), støttet av Norte Portugal regionaloperativprogram (NORTE 2020), under Portugal 2020 partnerskapsavtale, gjennom European Regional Development Fund (ERDF), prosjektet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), støttet av European Structural And Investment Funds, Lisboas regionale driftsprogram 2020. Patrícia Rodrigues ble finansiert av FCT (SFRH/BD/96026/2013) og João Almeida-Coelho var av Universidade do Porto/FMUP og FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Acetone | Sigma | 34580 | |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
Imidazole | VWR | 24720.157 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
Length Controller ( Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
Inverted Microscope (IX51) | Olympus |