Denne protokol har til formål at beskrive trin-for-trin teknikken med udvinding og vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flået kardiomyocytter. Denne metode gør det muligt at måle og akutmodulering af myofilamentfunktionen ved hjælp af små frosne biopsier, der kan indsamles fra forskellige hjertelokationer, fra mus til mænd.
I denne artikel beskriver vi de trin, der kræves for at isolere en enkelt permeabiliseret (“flået”) cardiomyocyte og fastgøre den til et kraftmåleapparat og en motor til at udføre funktionelle undersøgelser. Disse undersøgelser vil gøre det muligt at måle kardiomyocytstivhed (passiv kraft) og dens aktivering med forskellige calcium (Ca2+)-holdige opløsninger for blandt andet at bestemme: maksimal kraftudvikling, myofilament Ca2+-følsomhed (pCa50),samarbejdslighed (nHill) og force saneringshastigheden (ktr). Denne metode gør det også muligt at bestemme virkningerne af lægemidler, der virker direkte på myofilamenter, og af eksogene rekombinant proteiners udtryk for både aktive og passive egenskaber af kardiomyocytter. Klinisk, flået cardiomyocyte undersøgelser fremhæve patofysiologi af mange myokardiesygdomme og tillade in vitro vurdering af virkningen af terapeutiske indgreb rettet mod myofilamenter. Alt i alt muliggør denne teknik afklaring af hjertepatofysiologi ved at undersøge korrelationer mellem in vitro- og in vivo-parametre i dyremodeller og humant væv opnået under åben hjerte- eller transplantationsoperation.
Traditionelt har man fortrudt en vurdering af myokardiemekaniske egenskaber, hovedsagelig i flercellede præparater, såsom papillære muskler og trabeculae1,2. Multicellulære hjertemuskler strimler omfatter en heterogen population af celler, herunder kontraktile kardiomyocytter med et ukendt mønster af orientering og kraft generation, elektrisk aktivitet og stress / stamme distributioner samt en omgivende bindevæv matrix3,4. Et præparat uden kollagen og indeholdende en enkelt kardiomyocyt ville gøre det muligt at måle sarcomerelængde og kontraktile egenskaber på tværs af broen på en meget præcis og kontrolleretmåde 5,6. Derfor, i løbet af de sidste fire årtier, flere metoder blev udviklet giver mulighed for at undersøge de mekaniske, kontraktile, og afslapning egenskaber af en enkelt cardiomyocyte6,7. Disse cellers kontraktile funktion afhænger i høj grad af sarcomerelængde og cykelkinetik på tværs afbroen 3. Således er det ønskeligt at undersøge muskelfunktion direkte i enkelte isolerede hjerteceller, i betragtning af at det giver mulighed for at vurdere sarcomere længde og ydeevne samt cross-bro funktion og kontraktile egenskaber. Det er dog stadig en udfordring og udviklingaf 3, 6 , at der isoleres og fastgøres funktionelle kardiomyocytter med en rimelig optisk sarkomeropløsning, mens kraftmålingen på μN-niveauoptages. Andre udfordringer er den logistik, der skal installeres for at isolere kardiomyocytter fra frisk indsamlede biopsier. Uforudsigeligheden af indsamling af menneskelige biopsier kan f.eks.
Desuden har etiske bekymringer vedrørende udskiftning, reduktion og forfinelse af dyreforsøg til videnskabelige procedurer (principperne i 3R) fremmet undersøgelsesændringer på celle- og vævsniveau, helst i humane biopsier eller i mindre dyreprøver. Faktisk en progressiv raffinering af metoder til at vurdere hjertefunktion in vitro på et mindre niveau af kompleksitet giver mulighed for korrekt integration af resultaterne til hele kroppen og oversætte dem til det kliniske scenario7. I alt kan det være et tiltalende alternativ at anvende prøver, der er lagret ved -80 °C til at udtrække kardiomyocytter.
Det myokardievæv skæres i små stykker og homogeniseres med en morter og en støder. Resultatet af denne homogenisering er en suspension af flåede bundtede og isolerede celler med varierende grader af sarkolemmale skader, hvor i nærsynet er udsat for bademediet og alle de cellulære komponenter vaskes ud. Strukturer som myofibrils, der er længere væk fra sarkolemma bevares. Således sarcomere afkortning og funktionelle egenskaber i forbindelse med myofibrillar apparatet holdes intakt og kan registreres8,9.
Den cardiomyocyte kraft målesystem består af en elektromagnetisk motor, der anvendes til at justere cardiomyocyte længde, og en kraft transducer, der måler isometrisk cardiomyocyte sammentrækning. En permeabilized, eller flået, cardiomyocyte er placeret i et eksperimentelt kammer, der indeholder en afslappende opløsning ([Ca2 +] < 10 nM) og silicium-limet til 2 tynde nåle: en fastgjort til motoren og den anden til kraft transducer. Et optisk system bruges til at bestemme kardiomyocyt morfologi og sarcomere længde. Forsøgsprotokollen består ofte af en række kraftoptagelser på bufferopløsninger, der indeholder forskellige Ca2+-koncentrationer, bestemmelse af actin-myosin cross-bridge kinetik og måling af den passive spænding af de monterede kardiomyocytter ved foruddefinerede sarcomere længder (Figur 1). Isolering af permeabiliserede kardiomyocytter fra myokardieprøver frosset i flydende nitrogen (og efterfølgende opbevaret ved -80 °C) er en teknik, der anvender cellulær mekanik og proteinbiokemi til måling af maksimal Ca2+-aktiveret (aktiv) kraft pr. tværsnitsområde (Taktivt,kN∙m-2), Ca2+-uafhængig (passiv) spænding (Tpassiv, kN∙m-2),myofilaments Ca2+-følsomhed (pCa50),myofilaments cooperativity (nHill), force saneringshastigheden (ktr) samt sarkomere længde afhængigheder af Taktiv, Tpassiv, pCa50, nHill og ktr.
Målet med denne protokol er at illustrere og opsummere potentialet i kardiomyocyte kraft målesystem som en pålidelig procedure til at vurdere de funktionelle mekaniske egenskaber af enkelt flået kardiomyocytes isoleret fra frosne prøver fra forskellige arter.
In vitro-vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flåede kardiomyocytter repræsenterer en vigtig teknik til at tydeliggøre de ændringer, der forekommer på kardiomyocytniveau i fysiologisk (f.eks. stræk) og patologisk kontekst (f.eks. iskæmi). Denne metode har flere fordele, såsom at kræve en minimal mængde myokardi til at vurdere funktion i kardiomyocytter fremstillet af optøede prøver; ved hjælp af kardiomyocytter fra en bred vifte af arter (mus13,rotte1,14,15, kanin16, gris17, hund18, marsvin19 og human20) og forskellige hjerte steder, herunder atria, venstre og højre ventrikler eller en bestemt region af det infarkte hjerte. Desuden giver denne teknik mulighed for at levere specifikke koncentrationer af Ca2+ og energi (ATP), samtidig med at den måler funktionen af regulerings- og kontraktilestrukturer i deres oprindelige konfiguration.
På trods af enkelheden i denne teknik, er der nogle kritiske skridt. Det er vigtigt at sikre kvaliteten af hvert trin fra begyndelsen, herunder indsamling af prøver. Myofilament proteiner er modtagelige for proteaser21. Det er derfor obligatorisk at opbevare prøver i flydende nitrogen umiddelbart efter indsamlingen. Friske prøver, som ikke tidligere var frosne, vil udvikle betydeligt højere kræfter, så det er ikke tilrådeligt at blande måling udført i friske og frosne prøver i samme protokol. Det næstmest kritiske skridt er kardiomyocytters udvinding. Under denne procedure er det afgørende at opretholde prøven på is det meste af tiden. En proteasehæmmercocktail kan bruges til at reducere risikoen for proteinnedbrydning under ekstraktionen/permeabiliseringen22. For det tredje bør prøver skæres i mindre stykker ved hjælp af præcise skalpel bevægelser, da vi bemærkede nedsat kvalitet kardiomyocytter, når dette trin blev ignoreret. Et andet kritisk skridt er at vaske kardiomyocytter, da det er svært at have den rette balance mellem vask ud Triton (permeabilizes cellen, men fremmer sin ungluing) og holde så mange celler i supernatant som muligt. Det er vigtigt først at prøve ekstraktion og antal udvaskninger for hver prøve, art eller protokol. For eksempel, i vores hænder, bemærkede vi, at ZSF1 fede rotte væv ekstraktioner har en “fede” aspekt, som gjorde disse celler mere glatte under limning, men ikke vanskeligere at måle. Den måde, vi omgå dette problem var ved at udføre flere eksperimenter for at have et rimeligt antal celler pr dyr. Desuden er det afgørende at vælge en god celle til lim, nemlig med god rillation og rimelig længde. Hvis kardiomyocyt ikke har disse funktioner, vil det for det meste løsrive sig fra nålen tips eller udvikle ingen / lav kraft. Det er også vigtigt at bruge den korrekte lim til kardiomyocyt vedhæftet fil, i betragtning af tidspunktet for limning og dens effektivitet til at lime cellen til nålen. I vores hænder, silikone lim(Tabel af Materialer)hærder hurtigt (10-15 min) og stærk nok. Endelig er det sidste kritiske trin relateret til omhyggeligt at løfte kardiomyocyt 5 min efter limning af cellen (for at undgå limning af cellen til dækslæbet) og før du flytter den til brøndene (for at undgå den celle, der skal trækkes af mikroskopstadiet). Tabel 7 opsummerer den fejlfinding, der er forbundet med denne teknik, dens underliggende årsager og mulige løsninger til at løse hyppige problemer.
Den største begrænsning af denne metode er, at det ikke kan besvare alle de spørgsmål i forbindelse med myofilament kontraktility, såsom hvor hurtigt myofilaments aktivere / deaktivere. I in vivo indstilling, membran depolarisering, intracellulære Ca2 + stigning og dens diffusion til myofilamenter skal forekomme for myocytter til kontrakt, mens der i flået cardiomyocytes Ca2 + diffusion til myofilaments opstår straks, når cellen er nedsænket i Ca2 + opløsning. Denne hurtigere hastighed af Ca2 + diffusion vil bias myofilaments aktivering / deaktivering analyse23.
Disse eksperimenter er påvirket af forskellige faktorer, herunder temperatur, opløsning pH, mekanisk urolige (slack-re-stretch vs slap) og celle vedhæftet fil procedurer (pin slips vs lim), alle disse variabler tegner sig for litteratur uoverensstemmelser i form af ktr og sarcomere længde-afhængige stigning i kraft4,12.
Fremtidige fremskridt i teknikken omfatter udfører funktionelle undersøgelser i intakt snarere end permeabilized cardiomyocytes. Denne teknik har den ulempe at stole på kardiomyocytter frisk isoleret (ikke tidligere frosset). Et andet vigtigt spørgsmål, der ikke er direkte forbundet med denne metode, men som kan have en betydelig indvirkning på den, er relateret til den maksimale periode med frosset oplagring af stikprøver. Det er specifikt obligatorisk at fastsætte graden af nedbrydning af myofilament i hele opbevaringstiden (dvs. hvor længe frosne prøver kan opbevares for at sikre funktionelle data af god kvalitet fra de udtrukne kardiomyocytter).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Den Portugisiske Fond for Videnskab og Teknologi (FCT), Den Europæiske Union, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) og Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) til finansiering af UnIC (UID/IC/00051/2013) forskningsenhed. Dette projekt støttes af FEDER gennem COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), projektet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), støttet af det regionale operationelle program for Norte Portugal (NORTE 2020) under partnerskabsaftalen mellem Portugal 2020, gennem Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU), projektet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), støttet af europæiske struktur- og investeringsfonde, Lissabons regionale operationelle program 2020. Patrícia Rodrigues blev finansieret af FCT (SFRH/BD/96026/2013), og João Almeida-Coelho blev finansieret af Universidade do Porto/FMUP og FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Acetone | Sigma | 34580 | |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
Imidazole | VWR | 24720.157 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
Length Controller ( Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
Inverted Microscope (IX51) | Olympus |