포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경
Summary
칩 기반 의 초고해상도 광학 현미경 검사법은 형광 현미경 검사법에 대한 새로운 접근법이며 비용 효율성과 처리량에 이점을 제공합니다. 여기에서, 칩 준비 및 화상 진찰을 위한 프로토콜은 TIRF 현미경 검사법 및 현지화 기지를 둔 초고해상도 현미경 검사법을 위해 도시됩니다.
Abstract
총 내부 반사 형광 (TIRF)은 광학 단면으로 인해 향상된 대비를 제공하기 때문에 단일 분자 국소화 기반의 초고해상도 현미경 검사법에 일반적으로 사용됩니다. 기존의 접근법은 여기와 수집 모두에 높은 수치 조리개 현미경 TIRF 목표를 사용하여 시야와 처리량을 심각하게 제한하는 것입니다. 우리는 칩 기반 나노 스펙타카에게 불린 광학 도파관을 가진 화상 진찰을 위한 TIRF 여기를 생성하는 새로운 접근을 제시합니다. 이 프로토콜의 목적은 이미 구축된 설정에서 칩 기반 이미징이 어떻게 수행되는지 보여주는 것입니다. 칩 기반 나노 스펙의 주요 장점은 여기 및 수집 경로가 분리된다는 것입니다. 그런 다음 저배율 렌즈로 이미징을 수행할 수 있으며, 이로 인해 TIRF 이미지가 큰 시야를 차지하고 해상도가 소폭 감소합니다. 간 정현파 내피 세포(LSECs)는 기존의 초고해상도 현미경에 필적하는 해상도를 나타내는 직접 적층 광학 재건 현미경 검사법(d STORM)을 사용하여 이미지화되었습니다. 또한 500 μm x 500 μm 영역을 저배율 렌즈로 이미징하여 76nm의 해상도를 제공하여 높은 처리량 기능을 입증합니다. 컴팩트한 특성을 통해 칩 기반 이미징은 가장 일반적인 현미경으로 개조할 수 있으며 온칩 감지, 분광법, 광학 트랩핑 등과 같은 다른 온칩 광학 기술과 결합할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 높은 처리량 2D 초고해상도 이미징에 이상적으로 적합하지만 다중 모달 분석을 위한 훌륭한 기회를 제공합니다.
Introduction
단일 분자 국소화 현미경의 초기 데모 이후, 많은 변화는 다른 도전을 해결하기 위해 개발되었다1,2,3. 그러나 남아있는 한 가지 과제는 넓은 시야의 dSTORM 이미징입니다. 많은 dSTORM 설정은 동일한 대물렌즈를 사용하여 샘플을 자극하고 이미지를 이미지화합니다. 시야를 높이려면 낮은 배율 렌즈가 필요합니다. 낮은 배율과 낮은 수치 조리개(NA) 대물 렌즈는 일반적으로 피사계 심도가 크므로 국소화 정밀도를 감소시키는 평면 외 신호가 증가합니다. TIRF 목표는 일반적으로 평면 외 형광을 줄여 이미지 대비를 높이는 데 사용됩니다. TIRF를 통해, 여기는 에반네센트 필드4에의해 표면으로부터 약 150 nm의 광학 두께로 제한된다. TIRF 대목적 렌즈는 큰 NA를 필요로 하여 작은 시야(FOV)(예: 50 x 50 μm2)를생성하여 처리량을 크게 제한합니다. 그러나, 에바네센트 필드를 생성하는 다른 방법이 있습니다.
광학 도파관은 구조에 결합된 경우 빛을 제한하고 안내하는 구조입니다. 가장 일반적으로 도파관은 광섬유 기반 통신에서 사용됩니다. 포토닉 집적 회로의 주성분으로 2D 통합 도파관을 개발하기 위해 많은 노력을 기울였습니다. 이 기술은 저손실 나노 구조 광학 도파관을 일상적으로5로제작 할 수있는 지점으로 발전했습니다. 오늘날 전 세계의 여러 주조소가 포토닉 집적 회로를 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 도파관은 전체 내부 반사를 통해 빛을 안내하여 표면에 전단장을 표시합니다. 도파관 구조의 신중한 설계에 의해, 높은 강도는 에바네센트 분야에서 달성 될 수있다. 따라서 도파관 표면 바로 위에 놓인 시료는 이미징 응용 분야를 비추는 데에도 사용될 수 있습니다. 전도장은 도파관의 전체 길이 및 폭을 따라 생성되며, 따라서 임의로 큰6을만들 수 있다.
우리는 임의로 넓은 시야를 제공하는 TIRF dSTORM에 대한 새로운 접근 방식을 제시합니다. 여기와 수집을 위해 TIRF 렌즈를 사용하는 대신 광학 도파관의 전경을 사용합니다. 이는 여기 및 수집 광 경로를 분리하여 도파관 칩 조명에서 제공하는 주어진 파장에 대한 광학 절편을 손상시키지 않으면서 수집 광 경로를 따라 완전한 자유를 허용합니다. 따라서 저배율 렌즈는 TIRF 모드에서 매우 큰 영역을 이미지화하는 데 사용할 수 있지만 NA가 작을수록 측면 해상도가 감소합니다. 또한 여러 파장이 시스템을 재조정하지 않고 유도 및 감지할 수 있기 때문에 도파관7을사용하여 다중 컬러 이미징도 크게 간소화됩니다. 낮은 파장이 형광 점멸을 향상시키고 다중 색상 이미징을 위해 사용될 수 있기 때문에 이는 dSTORM에 유리합니다. 이미징 절차가 수행되는 방식에는 영향을 미치지 않지만 전도장의 침투 깊이는 파장의 함수로 변경됩니다. 이 칩은 라이브 셀 이미징8과 호환되며 미세 유체의 통합과 같은 응용 분야에 이상적입니다. 각 칩에는 사용자가 서로 다른 조건에서 이미지를 만들거나 광학 트래핑9 및 라만 분광법10을적용 할 수있는 수십 개의 도파관을 포함 할 수 있습니다.
칩 기반 시스템은 회절 제한 및 초고해상도 이미징 모두에 동일하게 작동합니다. 유사한 접근법은 2005년에 프리즘을 사용하여 에반네센트 필드 여기4를생성하는 것을 소개했습니다. 포토닉 칩은 또한 에바네센트 필드를 통해 흥분하지만, 현대 도파관 제작 기술을 사용하면 도파관으로 이국적인 빛 패턴을 생성 할 수 있습니다. 현재칩 기반 나노스프i 구현은 여기 필드가 도파관 표면 내부에 잠겨 있기 때문에 2D 이미징으로만 제한됩니다. 향후 개발은 3D 애플리케이션을 목표로 합니다. 부가적으로, 구조화된 조명 현미경 검사법과 같은 그밖 초분해능 기술은 동일한 칩 기지를 둔 현미경(11)를사용하여 개발되고 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
칩 기반 이미징은 기존의 dSTORM 이미징과 유사합니다. 따라서 기존 d STORM이미징과 동일한 접근 방식을 사용하여 이미지 품질을 측정할 수 있습니다. 사용자의 주요 차이점은 투명 유리 슬라이드가 불투명 한 Si-웨이퍼와 교환된다는 것입니다. 매우 다르게 보이지만 샘플 처리는 유리 슬라이드와 실질적으로 유사합니다. 칩은 매우 견고하며 웨이퍼 핀셋을 사용하여 쉽게 처리 할 수 있습니다. 이미징 절차 및 이미지 재구성은 일반 dSTORM 실험과 동일합니다. 기능성 칩 기반 현미경을 설정하면 포토닉 칩을 제외한 특별한 구성 요소가 필요하지 않습니다. 설정에 대한 자세한 내용은 전작6,7에서확인할 수 있습니다. 이 작업에 사용되는 칩은 표준 포토리소그래피8을사용하여 제작되었습니다.
시료 제제는 샘플 챔버의 제조를 포함한다. PDMS 프레임을 칩에 부착할 때 공기가 유입될 수 있는 작은 주름이나 립을 피하는 것이 중요합니다. PDMS를 부착할 때 접히면 핀처로 조심스럽게 제거하고 다시 부착하면 됩니다. 시료가 PDMS 챔버 내부에 준비되면 커버글래스를 눌러 영역을 밀봉해야 합니다. 커버글래스를 부착할 때 형성될 수 있는 기포를 피하는 것이 중요합니다. 기포가 형성되면 커버글래스를 부드럽게 제거하고 샘플 챔버에 PBS를 추가하여 샘플이 덮여 있는지 확인합니다. 커버 슬립의 준비 와 부착은 간단하게 다시 할 수 있습니다.
이 백서에 제안된 프로토콜을 사용하여 빛을 도파관에 결합하는 것이 단순화됩니다. 그러나 커플링을 제한할 수 있는 몇 가지 일반적인 문제가 있습니다. 첫째, 칩이 제대로 세척되지 않고 남은 PBS가 완전히 제거된 경우 도파관에 먼지나 결정화된 PBS가 있을 수 있습니다. 이것은 화상 진찰 지구에 있는 아주 작은 힘의 결과로 중요한 손실을 초래할 수 있습니다. 축축한 면봉을 사용하여 커버 유리 외부 영역을 청소하면 전력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 둘째, 도파관의 커플링 패싯이 손상되면(예: 부적절한 취급에 의해) 커플링 손실이 크게 증가할 수 있습니다. 가장자리의 광학 검사는 일반적으로 쉽게 손상을 공개합니다. 칩의 전체 커플링 면은 광섬유처럼 신중하게 연마 할 수 있으며 부드러운 커플링 면을 제공하여 결합 된 전력을 증가시킵니다.
빛이 결합된 후에, 화상 진찰 절차는 어떤 전통적인 dSTORM 설치에서와 동일합니다. 그림 2A에서설명한 것처럼 이미지에 불균일한 여기가 있는 경우 평균 모드가 잘 작동하지 않았을 가능성이 큽입니다. 가장 일반적인 두 가지 이유는 1) 평균 스택을 만들기 위해 캡처한 이미지가 너무 적고 2) 진동 거리가 너무 짧음/스텝 크기가 너무 크다는 것입니다. 너무 적은 이미지를 수집하면 일부 여기 패턴을 남길 수 있으며 평균은 불균일합니다. 평균 스택의 이미지 수를 늘려 쉽게 해결할 수 있습니다. 진동 거리가 너무 짧으면 모드 패턴이 충분하지 않기 때문에 비균일한 이미지가 발생할 수도 있습니다. 또한 진동 거리를 늘리거나 스텝 크기를 줄임으로써 쉽게 해결할 수 있습니다. 이 작품에서 우리는 20 μm 이상의 입력 레이저 빔을 스캔하고 적어도 300 개의 이미지를 획득하기 위해 압전 단계를 사용했습니다. 또 다른 접근법은 고속 갈보 미러를 사용하여 10-30 ms와 같은 단일 수집 시간 내에 입력 된 도파관 면을 가로 질러 빛을 스캔하는 것일 수 있습니다.이 옵션은 하위 세포 소기관이 일정한 움직임을 보이는 라이브 셀 TIRF 이미징에 적합합니다.
칩 기반 dSTORM은 전례 없는 넓은 면적의 TIRF 여기를 제공하므로 높은 처리량 이미징에 이상적입니다. 컴팩트한 특성을 통해 상용 시스템에 개조할 수 있으며, 이 경우 칩을 거꾸로 배치하여 거꾸로 설정하거나 투명 기판을 개발할 수 있습니다. 칩은 대량 제작되며 많은 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 현재, 주요 제한은 2D로 제한된다는 것입니다. 전도장은 도파관 표면에서 약 200 nm 떨어진 곳에서만 사용할 수 있으므로 이 지역 내의 형광단만 흥분할 것입니다. 통합 광학 분야는 새로운 이미징 질문을 다루고 기존 광학 에 새로운 가능성을 제공함으로써 가까운 장래에 칩 기반 현미경 검사법에 대한 많은 기회를 제공합니다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 유럽 연구 위원회 (B.S.A.에 부여 번호 336716)를 인정하고 싶습니다. 저자는 또한 비디오 녹화 및 편집에 대한 그녀의 귀중한 도움 이라티 라그프라구아에게 감사드립니다.
Materials
| 1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
| 2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
| 3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
| BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
| CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
| Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
| Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
| Filter Holder | Homemade | ||
| Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
| KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
| Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
| Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
| Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
| Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
| Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |
Referências
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