Driedimensionale beeldvorming van bacteriële cellen voor nauwkeurige cellulaire representaties en precieze eiwit lokalisatie

1. monstervoorbereiding Maak E. coli tl-licht voorbeeld vorming door ze te instrueren om een cytoplasmisch TL-eiwit6 uit te drukken of een membraan kleurstof5te gebruiken. Andere bacteriële soorten kunnen worden gebruikt in plaats van E. coli. Transformeren cellen via electroporatie met een plasmide die codeert voor het cytoplasmatische mcherry fluorescerende eiwitten.Opmerking: Verschillende TL-eiwitten van andere kleuren kunnen worden gebruikt. Kweek de transformanten op een LB plaat met het juiste antibioticum bij 37 °C. Verkrijg enkele kolonies en Identificeer positieve klonen door microscopie. Antibiotica resistente kolonies die rood lijken onder de Microscoop bevatten het plasmide dat mCherry draagt. Kweek 2 mL van de nachtelijke cultuur in LB vloeibare media met de juiste antibiotica bij 37 ° c in een schud incubator. Gebruik ofwel een kolonie van een plaat of een kleine hoeveelheid van een vrieskist als het entmateriaal.Opmerking: Gebruik de media die nodig zijn voor de bacteriecellen die voor het experiment zijn geselecteerd. Subcultuur de nachtelijke cultuur 1:1000 in 5 mL verse LB media en laat de cellen groeien tot exponentiële fase bij 37 ° c in een schud incubator voor 3 − 4 h. meet de OD600 van de cellen om te bevestigen dat ze zich in de exponentiële fase bevinden (d.w.z. , OD600 = 0,2 − 0,4).Opmerking: De beeldvorming kan worden uitgevoerd in elke groeifase, afhankelijk van het experiment dat wordt uitgevoerd. 2. voorbereiding schuiven Opmerking: Het is belangrijk om media te gebruiken die een lage auto fluorescentie hebben. Elk medium met een lage auto fluorescentie kan worden gebruikt. In dit experiment is 1% agarose M63 minimale media pads en afdichting met VaLaP19 vereist voorbeeld cellen in 3D. Bereid een 1% oplossing van agarose in 20 mL minimale media. Magnetron de oplossing totdat de agarose volledig is opgelost en de oplossing duidelijk wordt weergegeven. Bewaar de oplossing in een waterbad van 60 °C tot het klaar is voor gebruik.Opmerking: Deze oplossing kan worden gestald en gesmolten indien nodig of kan worden uitgedrukt in kleinere hoeveelheden die zo nodig worden gesmolten. Na meerdere toepassingen kan de media worden verkleurd en moet worden vervangen. Smelt VaLaP sealant op een hete plaat bij 80 − 100 °C.Opmerking: Bereid VaLaP, om te worden gebruikt als een Sealant, door het smelten van 50 g elk van Petroleum gelei, lanoline en paraffine samen in een bekerglas op een hete plaat bij 80 − 100 °C. Deze grote hoeveelheid VaLaP kan voor onbepaalde tijd op kamertemperatuur worden bewaard en is voldoende voor > 500 dia’s. Verwarmen bij > 100 °C zal leiden tot degraderen en de kleur zal donkerder worden. Plaats twee stapels van elk 3 20 mm x 20 mm afdekking aan de tegenoverliggende uiteinden van een glijbaan (zes totale afdek stroken). Pipetteer 200 μL agarose pad-oplossing op de glijbaan.Opmerking: Als u geen engineered fluorescerende vlek gebruikt, kan vóór deze stap een membraan kleurstof aan de agarose pad-oplossing worden toegevoegd. Rebreng de kleurstof in water en voeg kleurstof toe aan 1 mL van de agarose pad-oplossing tot een eindconcentratie van 5 μg/mL. Plaats onmiddellijk en stevig een tweede dia omlaag op de stapel afdek stroken om de agar af te vlakken en laat deze gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur stollen. Schuif voorzichtig van de bovenste dia af. Gebruik het grote uiteinde van een pipetpunt van 200 μL om individuele pads van de gel (~ 5 mm in diameter) op de glijbaan te knippen en gooi verkeerd ingedeelde of onnodige gel weg.Opmerking: Als Imaging meerdere stammen of voorwaarden, een aparte pad nodig voor elk een. Als er slechts één stam moet worden gefotografeerd, maak dan 3 − 4 pads om de dekslip te helpen ondersteunen. Pipetteer cellen meerdere malen omhoog en omlaag om celklonters te verstoren en te zorgen dat de cultuurgoed gemengd is. Pipetteer 1 μL subcultuur van stap 1,3 op een pad.Opmerking: Celvorm reconstructies vereisen afzonderlijke cellen die geen andere cellen aanraken. Bij gebruik van stationaire fase-of hogeceldichtheids culturen kan het nodig zijn om het monster 1:10 te verdunnen voordat u het op de pad plaatst. Laat de monster lucht drogen gedurende 5 − 10 min. Zorg ervoor dat de druppel volledig in de pad wordt opgenomen. Als er vloeistof overblijft, bewegen de cellen zich in de vloeistof en kunnen ze niet worden afgebeeld. Plaats een dekslip op de bovenkant van de pads. Sluit de Afdekstrook met gesmolten VaLaP af door zachtjes met een wattenstaafje rond de rand van de Afdekstrook te borstelen. Zorg ervoor dat u het van de bovenkant van de Afdekstrook weghoudt waar het objectief zal raken. De VaLaP zal harden in een kwestie van seconden, het afdichten van het monster. Onmiddellijk het monster te beelden.Opmerking: Het monster moet worden gefotografeerd zodra de dia is voorbereid. De cellen kunnen groeien op de pads, en als ze verdelen de reconstructies zal moeilijker. 3. ImagingRequirements Zorg ervoor dat de z-of scherpstel as van de Microscoop precieze bewegingen van minder dan 50 nm kan maken. Gebruik z piëzo-stadia (Zie tabel met materialen), beschikbaar op onderzoeksafstanden microscopen, omdat typische gemotoriseerde scherpstel apparaten niet in staat zijn om deze precisie te leveren.Opmerking: Uitgaande van de Nyquist-Shannon sampling criterium20, moet men de mogelijkheid hebben om te bewegen 0.5 x de kleinste gewenste stapgrootte, of 2x de gewenste ruimtelijke frequentie. Voor de 100 nm-stappen die in dit protocol nodig zijn, is een fase met een nauwkeurigheid van 50 nm of minder vereist. Zorg ervoor dat de Microscoop een 100x-doelstelling bevat met een minimaal numeriek diafragma (NA) van 1,45. Verzamel z-stapels tussen 200 − 400 verschillende cellen om ervoor te zorgen dat er voldoende cellen worden verkregen voor downstreamtoepassingen.Opmerking: Het aantal benodigde cellen hangt af van de onderliggende variabiliteit van het belang van de steekproef. Sommige van de cellen verzameld op dit punt zal het niet door de wederopbouw stappen te maken. Zorg ervoor dat de z-stack overeenkomt met de instellingen die worden gebruikt voor het vorm kanaal als een secundair fluorescerende kanaal (eiwit, metabolisch label, enz.) wordt gemeten. 4. Imaging Plaats de verzegelde glijbaan op de Microscoop en laat het 5 minuten zitten om de temperatuur met de omgeving te laten lopen, omdat de Microscoop ruimte op een andere temperatuur kan zijn dan de monster voorbereidingsruimte. Neem een fluorescerende z-stack van het monster.Opmerking: de z-stack moet het monster volledig bedekken met een z-afstand kleiner dan de scherptediepte. Voor een 1,45 NA 100x objectief en ~ 1 μm dikke E. coli cellen, 40 stappen bij 100 nm per stap werken goed. Voor grotere cellen of cellen die niet perfect vlak op het oppervlak liggen, kunnen 50 of meer stappen nodig zijn. Neem voldoende stappen op en zorg ervoor dat het monster volledig vervaagd is boven en onder. Gebruik de software die is gekoppeld aan de Microscoop (Zie tabel met materialen) om de Microscoop te bedienen. Focus op het midden van de cel met behulp van de Microscoop focus wielen. Controleer onder ND-acquisitie het z- vak om een z-stack te maken. Klik op de knop Home om het midden van de cel in te stellen als het beginpunt. Stel de stapgrootte in op 0,1 μm en stel het bereik in op 4 μm. Zorg ervoor dat het Z-apparaat is ingesteld op de piëzo-fase. Stel de fluorescentie kanalen onder het Lambda-venster in op de instellingen voor de fluorescerende moleculen die worden afgebeeld. In dit experiment werden GFP en mCherry gebruikt.Opmerking: Neem een extra z-stack met dezelfde stapgrootte en bereik in het tweede kleurkanaal als de 3D-verdeling van een extra fluorescerende kanaal gewenst is. In dit experiment, cytoplasmatische mcherry werd gebruikt om te bepalen van de celvorm en MreB-GFP werd gebruikt als een tweede kleurkanaal21. Zorg ervoor dat de volgorde van experiment is ingesteld op Lambda (z-serie), zodat het een volledige z-stack in elk kleurkanaal voordat u overschakelt. Klik op nu uitvoeren om de installatiekopie te starten en het bestand op te slaan onece één of beide z-stapels zijn voltooid. Ga naar een nieuw gebied op de pad en herhaal stap 4.2.2-4.2.5. 5. celreconstructie Snijd afzonderlijke cellen bij en sla de afbeeldingen op als een gestapeld TIFF-bestand, zodat er slechts één cel per bestand is. Zorg ervoor dat deze cel goed geïsoleerd is van andere cellen (d.w.z. ongeveer 5x de volledige halve breedte van de vervaging-functie in XY.Opmerking: dit kan worden gedaan met behulp van vrij beschikbare beeldanalyse software (Zie tabel van de materialen). Teken een vak rond een afzonderlijke cel en Dupliceer die cel 2x, eenmaal voor elk kanaal. Zorg ervoor dat het dubbele hyperstack-vakje is aangevinkt en verander het kanaal in 1 of 2, en zorg ervoor dat de segmenten de hele z-stack bevatten.Opmerking: Als alleen de vorm van de cellen en niet een aanvullend fluorescerende eiwit worden geimaging, zal er slechts één kanaal aanwezig zijn. Zodra beide stapels beschikbaar zijn, gaat u naar afbeeldingen | Stapels | Tools | Samenvoegen om de beelden te combineren met het eiwit kanaal eerst en de vorm kanaal tweede. Sla de nieuwe afbeelding op als een TIFF-bestand. Meet de vervaging functie van de microscoop met behulp van subdiffractie beperkt fluorescerende kralen22. Dit moet worden gedaan voor elke Microscoop en Microscoop doel, maar kan worden uitgevoerd voor of na het beeld van de monsters van belang. Gemiddelde samen meerdere onafhankelijke kralen met een handmatige interventie met behulp van beschikbare software (Zie tabel van materialen).Opmerking: Het eindproduct moet een 3D-beeld zijn van de vervaging-functie met dezelfde XYZ-afstand als de belangrijke monsters. Voer de voorwaartse convolutie Cell shape reconstructie scripts uit met behulp van de beschikbare software. De nieuwste versie van deze scripts kan vrijelijk worden gedownload van https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public. Maak een map in een map op het bureaublad met de bijgesneden afbeeldingen en het bestand cell_shape_settings_tri. txt van Shae-cellshape-Public/exampleData_tri. Bewerk cell_shape_setting_tri. txt om de juiste instellingen voor het experiment van belang te hebben. Voor dit experiment bevat het instellingenbestand de volgende regels:nm_per_pixel 70Z_scale 0,65stack_z_size 41stack_t_size 1Fstack_z_size 41Fstack_t_size 1stack_seperation_nm 100Fstack_seperation_nm 100psfScript-999 osuPSF20180726kleurovergang 1Opmerking: Dit tekstbestand is ingedeeld in secties en elke sectie wordt geparseerd in een eigen variabele. Hoewel veel van de instellingen niet hoeven te worden gewijzigd van experiment om te experimenteren, moet men ervoor zorgen dat de grootte van de z-stack (stack_z_size voor vorm, Fstack_z_size voor eiwit van belang), afstand van de z-stack (stack_seperation_ nm, Fstack_seperation_nm), relatieve focale verschuiving van de Microscoop (Z_scale)23, de pixelgrootte in XY (nm_per_pixel), en de naam van het script dat de vervaging functie van de Microscoop laadt (psfscript ) overeenkomen met het experiment. Het veld verloop moet worden ingesteld op 1 als het vorm kanaal cytoplasmically is gevuld en 0 als het een membraan-gekleurd object is. Voer Cell_shape_detector3dConvTriFolder functie uit (Shae-cellshape-Public/CellShapeDetectorTri/) met de tekenreeks naar de maplocatie gevolgd door het nummer van de cel om op te starten en het aantal cellen dat u wilt uitvoeren.Opmerking: Een voorbeeld voor de invoer ziet er als volgt uit: Cell_shape_detector3dConvTriFolder (‘ pad naar map met bijgesneden afbeeldingen ‘, startIndex in map, aantal cellen). Een typische cel kan tussen 5 − 20 minuten duren om de reconstructie te convergeren en te voltooien. Scherm de celreconstructies om ervoor te zorgen dat ze correct zijn voordat u de cellen voor een statistische analyse. Voer Screenfits uit (Shae-cellshape-Public/Shae-fitViewerGui/) om individuele celreconstructies visueel te flatscreen. Klik op de knop map selecteren wanneer de grafische gebruikersinterface (GUI) wordt geopend en selecteer vervolgens de map met de gegevensbestanden voor reconstructie (TRI. mat) die zijn gemaakt in stap 5,3. Vink het vakje aan naast de reconstructie van de cel als een cel misvormde of niet volledig convergeert (Figuur 3). Dit kan eruit zien als een cel met een gat, een platte kant of een tak die eruit komt. Hiermee wordt ‘Flag’ toegevoegd aan de bestandsnaam, zodat deze kan worden uitgesloten van een downstream-analyse.Opmerking: De gereconstrueerde cel kan worden vergeleken met de originele beelden. Dit kan vooral belangrijk zijn als uw cellen afkomstig zijn van verschillende heterogene populatie vormen. Voer enrichmentSmoothingSpline (Shae-cellshape-Public/) uit om een verrijkings profiel te maken van de relatieve concentratie van het eiwit van belang als functie van de Gaussiaanse kromming aan de oppervlakte. Selecteer elke map met TRI. mat-bestanden die zijn gemaakt in stap 5.3.3. Selecteer de zojuist gemaakte (5.5.1) curve. mat bestand.Opmerking: Een curve. mat-bestand wordt gemaakt voor elke map die is geselecteerd in 5.5.1. Alle verrijkings profielen worden op één grafiek weergegeven. Als afzonderlijke grafieken vereist zijn dan 5,5 uitvoeren voor elke map.Opmerking: Naast de precieze geometrische lokalisatie van een fluorescerend eiwit, zijn er vele andere manieren om de gegevens van het secundaire kanaal te analyseren, inclusief het tellen van het aantal, de grootte en de oriëntatie van objecten4.