Transformação da Raiz do Tomate Seguida de Inoculação com Ralstonia Solanacearum para Análise Genética Direta da Doença de Wilt Bacteriano

Ralstonia solanacearum, o agente causal da doença da murcha bacteriana, é um patógeno vascular devastador do solo com uma distribuição mundial que pode infectar uma grande variedade de espécies vegetais, incluindo batata, tomate, tabaco, banana, pimenta e berinjela, entre outras^1,2. As perdas de rendimento causadas pela Ralstonia podem chegar a 80-90% da produção em tomate, batata ou banana, dependendo da cultivar, clima, solo e outros fatores³. No entanto, o modelo de Ralstonia é consideravelmente pouco explorado em comparação com outros modelos envolvendo patógenos de plantas bacterianas, tais como Pseudomonas singae ou Xanthomonas spp. Além disso, a maioria dos estudos em interações entre plantas e micróbios está focada na planta modelo Arabidopsis thaliana. Embora a pesquisa que utiliza esses modelos tenha contribuído em grande parte para a nossa compreensão das interações entre plantas e bactérias, elas não abordam a necessidade atual de entender essas interações nas plantas agrícolas. Pesquisas voltadas para a compreensão da interação entre ralstonia e plantas agrícolas são essenciais para desenvolver soluções sustentáveis para combater a doença bacteriana, mas atualmente é dificultada pela falta de ensaios experimentais simples para caracterizar os diferentes componentes da interação. Particularmente, o tomate, um hospedeiro natural da Ralstonia,é a segunda cultura vegetal mais importante do mundo e é afetado por uma infinidade de doenças⁴, incluindo a doença de murcha bacteriana. Neste trabalho, desenvolvemos um método fácil para realizar análisegenética da infecção por Ralstonia do tomate. Este método baseia-se na transformação mediada de raízes de tomate da Agrobacterium,utilizando fluorescência DsRed como marcador de seleção^5,seguida pela inoculação de drenagem do solo de Ralstonia das plantas resultantes, contendo raízes transformadas expressando a construção de interesse. A versatilidade do ensaio de transformação raiz permite realizar a superexpressão genética ou o silenciamento genético mediado pela RNAi.

Uma limitação potencial deste método consiste no crescimento residual de raízes não transformadas. Isso é particularmente importante nos casos em que o plasmídeo utilizado carece de um gene de repórter que permita a seleção de raízes transformadas. Para resolver esse problema, desenvolvemos um método alternativo baseado na seleção de antibióticos, que inibe o crescimento de raízes não transformadas, permitindo ao mesmo tempo o crescimento de raízes transformadas saudáveis resistentes a antibióticos. Uma vez que A. rizógenes não induz a transformação de brotos, eles são suscetíveis ao antibiótico e, portanto, devem ser mantidos separados do meio contendo antibióticos.

Embora a resistência vegetal contra a Ralstonia não seja bem compreendida, vários relatos associaram alterações na parede celular ao aumento da resistência à murcha bacteriana^6,,7,,8,9. Sugere-se que essas alterações na parede celular afetem o desenvolvimento vascular, aspecto essencial para o estilo de vida da Ralstonia dentro da planta¹⁰. Mutações nos genes que codificam os sintetizadores de celulose CESA4, CESA7 e CESA8 em Arabidopsis thaliana têm sido demonstradas para prejudicar a integridade da parede celular secundária, causando maior resistência à Ralstonia,que parece estar ligada à sinalização ABA⁸. Portanto, como prova de conceito para o nosso método, realizamos o silenciamento genético mediado pela RNAi de SlCESA6 (Solyc02g072240), um sintetizador secundário de celulose de parede celular, e ortolog de AtCESA8 (At4g18780). A inoculação subseqüente de drenagem do solo com ralstonia mostrou que silenciar SlCESA6 aumentou a resistência aos sintomas de murcha bacteriana, sugerindo que a resistência mediada pela parede celular à Ralstonia é provavelmente conservada no tomate, e validando nosso método para realizar análise genética da resistência bacteriana murcha nas raízes do tomate. Aqui, descrevemos este método em detalhes, permitindo abordagens genéticas para entender a doença de murcha bacteriana em um tempo relativamente curto e com pequenas exigências de equipamentos e espaço de crescimento vegetal.