Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi
Summary
Burada, Drosophila larva beyninin canlı bir hazırlığında son derece hareketli dendritik filopodia’yı görüntülemek için uyguladığımız yöntemi ve dendritin kantitatif değerlendirmeleri için hızlandırılmış 3D görüntüleme veri kümelerini ölçmek için geliştirdiğimiz protokolü anlatıyoruz. nöronlar gelişmekte dinamikleri.
Abstract
Son derece hareketli dendritik filopodia erken gelişim evrelerinde nöronlarda yaygın olarak mevcuttur. Bu araştırmacı dinamik dallar çevredeki ortamı örneklemektedir ve potansiyel sinaptik ortaklarla temaslar başlatır. Dendritik dal dinamiği ile sinaptogenez arasındaki bağlantı iyi kurulmuş olsa da, gelişimsel ve aktiviteye bağlı süreçlerin dendritik dal dinamiği nasıl düzenlediği tam olarak anlaşılamamıştır. Bunun nedeni kısmen canlı görüntüleme ve in vivo sistemi kullanılarak bu ince yapıların kantitatif analizleri ile ilgili teknik zorluklardır. Drosophila larva ventral lateral nöronlar (LNvs) kullanarak dendrit dinamiği incelemek için bir yöntem oluşturduk, bu yöntem genetik yaklaşımlar kullanılarak ayrı ayrı etiketlenebilir ve canlı görüntüleme için erişilebilir. Bu sistemden yararlanarak, tüm dendritik çardakların dal dinamiklerini yakalamak için protokoller geliştirdik. Daha sonra sürüklenme düzeltme ve dekonvolution yoluyla görüntü kalitesini artırmak için post-processing gerçekleştirdik ve ardından tüm şube terminallerinin mekansal konumlarını ekleyerek tek dal düzeyinde dal dinamiklerini analiz ettik. Son olarak, terminal izleme tarafından oluşturulan koordinat bilgilerini kullanarak şube dinamiklerini ölçmek için R komut dosyaları(Tamamlayıcı Dosya)ve özel parametreler geliştirdik. Topluca, bu protokol bize yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük ile nöronal dendritik arbor dal dinamikleri ayrıntılı bir nicel açıklamasını elde etmek için izin verir. Geliştirdiğimiz yöntemler genellikle hem in vitro hem de in vivo koşullarda seyrek etiketli nöronlar için geçerlidir.
Introduction
Dendritler duyusal ve sinaptik girişi alan ve işleyen özel nöronal bölmelerdir. Dendritik çardakların karmaşık ve basmakalıp yapısı, keşiflerinden bu yana yoğun bir soruşturma altında. Model sistemleri, Xenopus optik tectal nöronlar, civciv retinaganglion hücreleri ve drosophila sisteminde dendritik arborization (da) nöronlar da dahil olmak üzere, geliştirme, remodeling ve plastisite incelemek için kurulmuştur nöronal dendritler1,2,3,4. Drosophila ventral lateral nöronlar (LNvs) görsel projeksiyon nöronlar bir grup başlangıçta sinek davranışları sirkadiyen düzenleme önemli işlevleri için tanımlanan5. Çalışmalar da larva fotoreseptörleri doğrudan postsinaptik hedef olarak larva LNvs rolünü ortaya (PRs)6,7. Daha da önemlisi, farklı ışık rejimlerinde gelişmekte olan larvaların kültürlenerek LNvs ‘dendritik arbors boyutunu güçlü etkiler, dendritik plastisite eğitimi için yeni bir model olarak LNvs uygunluğunu gösteren7. Grubumuzdan son çalışmalar daha lnv dendrit boyutu ve dendritik dalların dinamik davranış deneyim bağımlı plastisite8,9görüntülemek gösterir. Bu çalışmanın bir parçası olarak, 2veya 3 instar larvasından LNvs’nin dendrit dinamiği üzerinde analiz yapmak için yeni bir canlı görüntüleme ve niceleme protokolü geliştirdik.
Drosophila larva beyninin şeffaf doğası onu canlı görüntüleme için ideal hale getirir. Ancak, LNvs dendritik arbors larva beyin lobmerkezindeyoğun innerve larva optik nöropil (LON) bulunmaktadır 6 . Bozulmamış beyin dokusunda ince dendrit dalları ve filopodia görüntüleri yakalamak için, biz ışık penetrasyon derinliğini artırır ve canlı görüntüleme deneyleri sırasında fototoksisite azaltır iki foton mikroskopi, kullanmak10. Bu kurulumu kullanarak, nöronun belirgin morfolojik bozulmasını gözlemlemeden LNvs üzerinde 30 dakikadan fazla canlı görüntüleme deneyleri gerçekleştirdik. Buna ek olarak, Flip-out tekniğini kullanarak genetik manipülasyonlar bize bir membran gfp etiketli ile bireysel LNvs etiketlemek için etkin, hangi da bireysel dalların hareketlerini izlemek için kritik11,12,13 .
LNv dendritik arbor’daki tüm dalların dinamik davranışını optimum optik çözünürlüğe sahip olarak yakalamak için, 10 ila 30 dakika boyunca kare başına 1 dk yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip, yeni diseksiyonlu larva beyin ekstrelerinde hızlandırılmış 3D görüntüleme gerçekleştirdik. dendritler son derece dinamiktir ve dalların büyük bir yüzdesi 10 dk’lık pencerede gözlemlenebilir değişiklikler gösterir. Bu, dendrite dinamiğinin incelenmesinde, 4B görüntü veri kümelerine dayalı dal davranışının ölçülmesinde en önemli teknik zorluklardan birine yol açar. Daha önce kurulan yöntemler, doğruluk eksikliği ve aşırı zaman gereksinimi de dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar vardır. Bu nedenle, görüntü işleme sonrası, şube terminallerinin manuel işaretleme ve görüntü ek açıklama yazılımı kullanarak otomatik 4D nokta izleme birleştiren yarı otomatik bir yöntem geliştirdik. Şube terminallerinin hareketlerini noktalardaki 3B koordinatları esas alınabılarak farklı zaman noktalarında hesaplıyoruz. Veriler daha sonra dışa aktarılır ve şube dinamiğinin nicel ölçümlerini üretmek için analiz edilir. Bu yöntem, mevcut dalların uzatma ve geri çekilme olaylarının süresini ve kapsamını ve yeni dalların oluşumunu doğru bir şekilde değerlendirerek çok sayıda nöronda dendrite dinamiklerini izlememizi sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, Drosophila larva beyinlerinde tek tek etiketlenmiş nöronlarda dendritik dalların dinamik davranışını kaydetmek ve ölçmek için geliştirdiğimiz bir protokolü tanımlıyoruz. Özellikle, canlı görüntüleme protokolümüz, bir larva LNv’nin dendritik arbor’unu yakalamamızı ve dendrit dallarının dinamik durumunu küresel olarak görmemizi sağlayan özel parametreler içerir. Ancak, sayısallaştırma yöntemlerimiz ağırlıklı olarak dal terminallerinin ek açıklamalarına dayandığı…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Proje numarası 1ZIANS003137.
Materials
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| high vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES | |||
Referências
- Wong, W. T., Wong, R. O. L. Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis. Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).
- Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation. The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).
- Cline, H., Haas, K. The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).
- Helfrich-Forster, C., et al. Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).
- Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil. Biologia do Desenvolvimento. 358 (1), 33-43 (2011).
- Yuan, Q., et al. Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System. Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).
- Sheng, C., et al. Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis. Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).
- Yin, J., et al. Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity. Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Harrison, D. A., Perrimon, N. Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila. Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9, 47 (2011).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Niell, C. M., Smith, S. J. Live optical imaging of nervous system development. Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).
- Jacquemet, G., et al. FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Urbančič, V., et al. Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).
