Dendriter är specialiserade neuronala fack som tar emot och bearbetar sensoriska och synaptiska indata. Den komplexa och stereotypa strukturen av dendritiska arbors har varit under intensiv utredning sedan deras upptäckt. Ett antal modellsystem, inklusive Xenopus Optic tectal nervceller, chick retinal ganglion celler, och dendritiska arborization (da) nervceller i Drosophila systemet, har inrättats för att studera utveckling, ombyggnad och plasticitet av neuronala dendriter^1,2,3,4. Drosophila ventrala laterala neuroner (lnvs) är en grupp av visuella projektion neuroner initialt identifierats för sina viktiga funktioner i dygns reglering av flyga beteenden⁵. Studier avslöjade också rollen av larv lnvs som direkt postsynaptiska mål för larv fotoreceptorer (PRS)^6,7. Viktigare, odling utveckla larver i olika ljus regimer starkt påverkar storleken på LNvs dendritiska arbors, visar lämpligheten av LNvs som en ny modell för att studera dendritiska plasticitet⁷. Nyligen arbete från vår grupp ytterligare visar att både storleken på LNV Dendrit och det dynamiska beteendet hos dendritiska grenar displayen Experience-beroende plasticitet^8,9. Som en del av detta arbete har vi utvecklat en ny Live Imaging och kvantifiering protokoll för att utföra analyser på Dendrit dynamiken i lnvs från 2^nd eller 3^RD INSTAR larver.

Den transparenta karaktären hos Drosophila larv Brain gör den idealisk för levande avbildning. Men den dendritiska arbors av lnvs är belägna i tätt innerverade larv Optic neuropil (Lon) i mitten av larv Brain LOB⁶. För att fånga bilder av fina Dendrit grenar och filopodia i intakt hjärnvävnad, vi använder två-Photon mikroskopi, vilket ökar djupet av ljus inträngning och minskar fototoxicitet under Live Imaging experiment¹⁰. Med hjälp av denna inställning, vi framgångsrikt utfört Live Imaging experiment på LNvs för över 30 min utan att observera uppenbara morfologiska försämring av neuron. Dessutom, genetiska manipulationer med hjälp av flip-out tekniken möjligt för oss att märka de enskilda lnvs med ett membran taggade GFP, som också är kritisk för övervakning av förflyttningar av enskilda grenar^11,12,13 .

För att fånga det dynamiska beteendet hos alla grenar på LNV dendritiska Arbor med optimal optisk upplösning, utförde vi tidsförlopp 3D-avbildning på nyligen dissekerade larv Brain djur med en hög rumslig upplösning på 1 min per ram för 10 till 30 min. utveckla LNV dendriter är mycket dynamisk, med en stor andel av grenarna visar observerbara förändringar inom 10 min fönster. Detta leder till en av de viktigaste tekniska utmaningarna i att studera Dendrit dynamik, kvantifiera gren beteende baserat på 4D bild datauppsättningar. Tidigare etablerade metoder har olika begränsningar, inklusive bristande noggrannhet och överdriven tid krav. Därför har vi utvecklat en semi-automatisk metod som kombinerar bild efter bearbetning, manuell märkning av grenterminaler, och automatisk 4D spot tracing med hjälp av en bild anteckning programvara. Vi beräknar Förflyttningar av grenterminaler vid olika tidpunkter baserat på 3D-koordinaterna för fläckarna. Data exporteras sedan och analyseras för att producera kvantitativa mätningar av filialens dynamik. Denna metod bedömer noggrant varaktigheten och omfattningen av förlängning och återgående händelser av befintliga grenar, samt bildandet av nya grenar, vilket gör att vi kan övervaka Dendrit dynamik i ett stort antal nervceller.