Дендриты являются специализированными нейронными отсеками, которые принимают и обрабатывают сенсорный и синаптический вход. Сложная и стереотипная структура дендритных беседок с момента их обнаружения подвергалась интенсивному исследованию. Ряд типовых систем, в том числе Xenopus оптических тектальных нейронов, цыпленка клетки ганглия, и дендритной беседки (да) нейронов в системе Drosophila, были созданы для изучения развития, реконструкции и пластичности нейронные дендриты^1,2,3,4. Drosophila ventral боковые нейроны (LNvs) представляют собой группу визуальных нейронов проекции первоначально определены для их важных функций в циркадной регуляции летать поведения⁵. Исследования также показали роль личинок LNvs в качестве прямой postsynaptic цель личинок фоторецепторов (PRs)^6,7. Важно отметить, что культивирование развивающихся личинок в различных световых режимах сильно влияет на размер дендритных беседок LNvs, демонстрируя пригодность LNvs как новой модели для изучения дендритной пластичности⁷. Последние работы нашей группы также указывает на то, что как размер lNv дендрита и динамическое поведение дендритных ветвей отображают опыт-зависимую пластичность^8,9. В рамках этой работы мы разработали новый живой протокол визуализации и количественной оценки для проведения анализа динамики дендрита LNvs от^2-го или^3-го инстаровых личинок.

Прозрачный характер личиночного мозга Дрозофилы делает его идеальным для живой визуализации. Тем не менее, дендритные беседки LNvs расположены в плотно иннервированных личиночной оптической нейропил (LON) в центре личинки доли мозга⁶. Для захвата изображений тонких ветвей дендритов и филоподии в нетронутой ткани мозга, мы используем двухфотонную микроскопию, которая увеличивает глубину проникновения света и снижает фототоксичность во время живых экспериментов изображений¹⁰. Используя эту установку, мы успешно провели живые эксперименты изображения на LNvs в течение более 30 минут, не наблюдая очевидного морфологического ухудшения нейрона. Кроме того, генетические манипуляции с использованием flip-out техники позволили нам маркировать отдельные LNvs с мембраной помечены GFP, который также имеет решающее значение для мониторинга движений отдельных ветвей^11,12,13 .

Чтобы зафиксировать динамичное поведение всех ветвей на дендритной беседке LNv с оптимальным оптическим разрешением, мы выполнили замедленное 3D-изображение на свежерассеченных личиночных вылазках мозга с высоким пространственным разрешением при 1 мин на рамку в течение 10-30 мин. Разработка LNv дендриты очень динамичны, при этом большой процент ветвей отображает наблюдаемые изменения в окне 10 мин. Это приводит к одной из основных технических задач в изучении динамики дендрита, количественной оценке поведения ветвей на основе наборов данных 4D-изображений. Ранее установленные методы имеют различные ограничения, включая отсутствие точности и чрезмерные временные требования. Поэтому мы разработали полуавтоматический метод, который сочетает в себе изображение после обработки, ручная маркировка ветвей терминалов и автоматическое отслеживание 4D-точек с помощью программного обеспечения для аннотации изображений. Мы вычисляем движения ветвей терминалов в разных точках времени на основе 3D-координат пятен. Затем данные экспортируются и анализируются для получения количественных измерений динамики отрасли. Этот метод точно оценивает продолжительность и масштабы расширения и опрокидки событий существующих ветвей, а также формирование новых ветвей, что позволяет отслеживать динамику дендрита в большом количестве нейронов.