Dendrites er spesialisert neuronal rom som mottar og behandler sensorisk og Synaptic innspill. Den komplekse og stereotype strukturen av dendrittiske arbors har vært under intens etterforskning siden oppdagelsen deres. En rekke modellsystemer, inkludert Xenopus optikk tectal neurons, chick retinal Ganglion celler, og dendrittiske arborization (da) neurons i Drosophila systemet, har blitt etablert for å studere utvikling, remodeling og plastisitet av neuronal dendrites^1,2,3,4. Drosophila ventrale lateral neurons (LNvs) er en gruppe av visuell projeksjon neurons utgangspunktet identifisert for deres viktige funksjoner i døgn regulering av fly atferd⁵. Studier avslørte også rollen som larvestadiet LNvs som direkte postsynaptic målet for larvestadiet fotoreseptorene (PRs)^6,7. Viktigere, dyrking utvikle larver i ulike lys regimer sterkt påvirker størrelsen på LNvs ‘ dendrittiske arbors, demonstrere egnetheten av LNvs som en ny modell for å studere dendrittiske plastisitet⁷. Nyere arbeid fra vår gruppe videre indikerer at både størrelsen på LNv dendrit og den dynamiske atferden til dendrittiske grener displayet Experience-avhengige plastisitet^8,9. Som en del av dette arbeidet, utviklet vi en ny Live Imaging og kvantifisering protokoll for å utføre analyser på dendrit dynamikken i LNvs fra 2^nd eller 3^Rd skikkelsen larver.

Den gjennomsiktige natur Drosophila larvestadiet hjernen gjør det ideelt for Live Imaging. Imidlertid er den dendrittiske arbors av LNvs ligger i tett innervated larvestadiet optikk neuropil (LON) i sentrum av larvestadiet hjerne flik⁶. For å ta bilder av fine dendrit grener og filopodia i intakt hjernevev, bruker vi to-Foton mikroskopi, noe som øker dybden av lys penetrasjon og reduserer Phototoksisitet under Live Imaging eksperimenter¹⁰. Ved hjelp av dette oppsettet, vi vellykket utført Live Imaging eksperimenter på LNvs for over 30 min uten å observere åpenbare morfologiske forverring av Nevron. I tillegg genetisk manipulasjoner ved hjelp av flip-out teknikken gjorde oss i stand til å merke den enkelte LNvs med en membran merket GFP, som også er avgjørende for å overvåke bevegelsene til enkelte grener^11,12,13 .

For å fange den dynamiske atferden til alle grener på LNv dendrittiske Arbor med optimal optisk oppløsning, utførte vi time-lapse 3D Imaging på fersk dissekert larvestadiet hjernen explants med en høy romlig oppløsning på 1 min per ramme for 10 til 30 min. utvikle LNv dendrites er svært dynamiske, med en stor prosentandel av grenene som viser merkbare endringer innenfor 10 min vinduet. Dette fører til en av de viktigste tekniske utfordringene i å studere dendrit dynamikk, kvantifisere gren atferd basert på 4D bildedata settene. Tidligere etablerte metoder har ulike begrensninger, inkludert mangel på nøyaktighet og overdreven tid kravet. Derfor har vi utviklet en semi-automatisk metode som kombinerer bilde etterbehandling, manuell merking av grenen terminaler, og automatisk 4D flekk sporing ved hjelp av et bilde merknad programvare. Vi beregner bevegelsene til gren terminaler på forskjellige tidspunkter basert på 3D-koordinatene til flekkene. Dataene eksporteres deretter og analyseres for å gi kvantitative målinger av gren dynamikken. Denne metoden vurderer nøyaktig varigheten og omfanget av forlengelse og tilbaketrekking hendelser av eksisterende grener, samt dannelsen av nye grener, slik at vi kan overvåke dendrit dynamikk i et stort antall neurons.