수상돌기는 감각및 시냅스 입력을 수신하고 처리하는 특수 신경 구획입니다. 수지상 아버의 복잡하고 고정 된 구조는 발견 이후 강도 높은 조사를 받고 있습니다. 제노푸스 광학 지각 신경세포, 병아리 망막 신경절 세포, 초파리 시스템의 수지상 수공(da) 뉴런을 포함한 다수의 모델 시스템이 개발, 리모델링 및 가소성을 연구하기 위해 설립되었습니다. 신경 모수석^1,2,3,4. Drosophila 복부 측측 뉴런 (LNvs)은 비행 행동의 circadian 규칙에 있는 그들의 중요한 기능을 위해 처음에 확인된 시각적 투영 뉴런의 단^5. 연구는 또한 애벌레 광수용체 (P)^6,7의직접적인 후발성 표적으로 애벌레 LNvs의 역할을 밝혔다. 중요한 것은, 다른 빛 정권에서 개발 애벌레를 배양하는 것은 강하게 수지상 가소성 연구를위한 새로운 모델로 LNvs의 적합성을 입증, LNvs의 크기에 영향을 미친다^7. 우리 그룹의 최근 연구는 더 LNv 덴드 라이트의 크기와 수지상 가지의 동적 동작 모두 경험 의존가소성^표시8,9를나타냅니다. 이 작업의 일환으로, 우리는 2^nd 또는 3^rd instar 애벌레에서 LNvs의 수상 돌기 역학에 대한 분석을 수행하기 위해 새로운 라이브 이미징 및 정량화 프로토콜을 개발했습니다.

Drosophila 애벌레 두뇌의 투명한 본질은 살아있는 화상 진찰을 위해 이상적입니다. 그러나, LNvs의 수지상 아버는 애벌레 뇌 엽^6의중심에 조밀하게 내심이 있는 애벌레 시신경제(LON)에 위치한다. 손상되지 않은 뇌 조직에서 미세 한 모수석 가지와 필로포디아의 이미지를 캡처하기 위해 2 광자 현미경을 사용하여 빛 침투깊이를 높이고 라이브 이미징 실험¹⁰동안 광독성을 감소시킵니다. 이 설정을 사용하여, 우리는 성공적으로 뉴런의 명백한 형태 학적 악화를 관찰하지 않고 30 분 이상 LNvs에 라이브 이미징 실험을 수행했다. 또한, 플립 아웃 기술을 사용하여 유전자 조작은 우리가 또한 개별 지점의 움직임을 모니터링하기위한 중요한 멤브레인 태그 GFP로 개별 LNvs를 라벨 수^{있도록 11,12, 13} .

최적의 광학 해상도로 LNv 수지상 아버의 모든 가지의 동적 거동을 포착하기 위해 프레임당 1분에서 10~30분 동안 높은 공간 해상도로 새로 해부된 애벌레 뇌 이식에 대한 타임랩스 3D 이미징을 수행했습니다. 수상돌기는 매우 동적이며, 분기의 큰 비율은 10 분 창 내에서 관찰 가능한 변화를 표시합니다. 이것은 4D 이미지 데이터 세트를 기반으로 분기 동작을 정량화, 수상 돌기 역학을 공부의 주요 기술적 과제 중 하나에 이르게. 이전에 설정된 메서드에는 정확도 부족 및 과도한 시간 요구 사항을 비롯한 다양한 제한 사항이 있습니다. 따라서 이미지 후처리, 지점 단자의 수동 마킹 및 이미지 주석 소프트웨어를 사용하여 자동 4D 스팟 추적을 결합한 반자동 방법을 개발했습니다. 점점의 3D 좌표를 기준으로 서로 다른 시점에서 분기 터미널의 움직임을 계산합니다. 그런 다음 데이터를 내보내고 분석하여 분기 역학의 정량적 측정을 생성합니다. 이 방법은 기존 가지의 확장 및 철회 이벤트의 지속 기간 및 범위뿐만 아니라 새로운 가지의 형성을 정확하게 평가하여 많은 수의 뉴런에서 수상 돌기 역학을 모니터링 할 수 있게합니다.