デンドライトは、感覚入力とシナプス入力を受け取り、処理する特殊なニューロンコンパートメントです。樹状樹木の複雑でステレオタイプ化された構造は、発見以来、厳しい調査を受けています。脱視管系におけるキセノプス光学系ニューロン、ひよこ甲状腺細胞、樹状樹盤形成(da)ニューロンを含む多くのモデルシステムが、その発達、改造、可塑性を研究するために確立されている。神経デンドライト^1,2,3,4.ショウジョウバエ腹部横ニューロン(LNvs)は、ハエ行動の概日調節における重要な機能について最初に同定された視覚投影ニューロンのグループ^{である5。}研究はまた、幼虫光受容体(PR)6、7の直接ポストナプティックターゲットとしての幼虫LNvsの役割を明らかにした。重要なことに、異なる光系で幼虫を発達させる培養は、LNvsの樹状樹木の樹木の大きさに強く影響を与え、樹状可塑^性7を研究するための新しいモデルとしてLNvsの適合性を実証する。我々のグループからの最近の研究は、LNvデンドライトのサイズと樹状枝の動的挙動の両方が経験に依存する可塑^性8、9を示すことをさらに示している。この研究の一環として、我々は新しいライブイメージングおよび定量プロトコルを開発し、2^番目または3^番目の幼虫からLNvsのデンドライトダイナミクスに関する分析を行った。

ショウジョウバエ幼虫脳の透明な性質は、ライブイメージングに最適です。しかし、LNvsの樹状樹木は、幼虫脳^葉6の中心にある密に内来性の幼虫視神経ピル(LON)に位置している。無傷の脳組織内の微細なデンドライトの枝とフィロポディアの画像をキャプチャするために、我々は光の浸透の深さを増加させ、ライブイメージング^実験10の間に光毒性を減少させる2光子顕微鏡を利用する。このセットアップを用いて、ニューロンの明らかな形態学的劣化を観察することなく、30分以上のLNvsでライブイメージング実験を行いました。さらに、フリップアウト技術を用いた遺伝子操作により、個々のLNvsにGFPというタグが付けられた膜でラベルを付け、個々の枝の動きを監視するためにも重要です^11,12,13.

最適な光学分解能を持つLNv樹状樹木の全ての枝の動的挙動を捉えるために、新たに解剖された幼虫脳移植所でタイムラプス3Dイメージングを行い、フレームあたり1分間1分の高い空間分解能を10~30分間行いました。デンドライトは非常に動的であり、ブランチの大部分は10分のウィンドウ内で観察可能な変化を表示します。これは、4D画像データセットに基づいて分岐動作を定量化するデンドライトダイナミクスを研究する際の主な技術的課題の1つにつながります。以前に確立された方法には、精度の欠如や過剰な時間要件など、さまざまな制限があります。そこで、画像後処理、分岐端子の手動マーキング、画像アニテーションソフトを用いて自動4Dスポットトレースを組み合わせた半自動方式を開発しました。スポットの3D座標に基づいて、異なる時点での分岐端子の動きを計算します。その後、データがエクスポートおよび分析され、分岐ダイナミクスの定量的測定値が生成されます。この方法は、既存の分岐の延長および引き込みイベントの持続時間と範囲、および新しい分岐の形成を正確に評価し、多数のニューロンでデンドライトダイナミクスを監視することを可能にします。