Dendrites zijn gespecialiseerde neuronale compartimenten die ontvangen en verwerken van sensorische en synaptische input. De complexe en stereotiepe structuur van dendritische Arbors is sinds hun ontdekking intensief onderzocht. Een aantal modelsystemen, waaronder Xenopus optische tectale neuronen, Chick retinale ganglioncellen en dendritische arborization (da) neuronen in het Drosophila systeem, zijn opgericht om de ontwikkeling, verbouwing en plasticiteit van neuronale dendrites^1,2,3,4. Drosophila ventrale laterale neuronen (Lnv’s) zijn een groep visuele projectie neuronen die aanvankelijk werden geïdentificeerd voor hun belangrijke functies in de circadiane regulatie van vlieggedrag⁵. Studies onthulde ook de rol van larvale lnvs als de directe postsynaptische doelstelling van de larvale fotoreceptoren (PRS)^6,7. Belangrijk is dat het kweken van larven in verschillende licht regimes sterk van invloed is op de grootte van Lnv’s ‘ dendritische Arbors, die de geschiktheid van LNvs aantonen als een nieuw model voor het bestuderen van dendritische plasticiteit⁷. Recent werk van onze groep wijst er verder op dat zowel de grootte van de LNV dendriet als het dynamische gedrag van de dendritische takken ervaring-afhankelijke plasticiteit weergeven^8,9. Als onderdeel van dit werk ontwikkelden we een nieuw live beeld-en kwantificerings protocol om analyses uit te voeren over de dendriet-dynamiek van Lnv’s van 2^ND of 3^RD instar larven.

De transparante aard van de hersenen Drosophila larvale maakt het ideaal voor Live beeldvorming. Echter, de dendritische Arbors van lnvs bevinden zich in de dichtbevolkte larvale optische neuropil (LON) in het midden van de larvale hersenen kwab⁶. Om beelden van fijne dendriet takken en filopodia in het intacte hersenweefsel vast te leggen, gebruiken we twee-photon microscopie, die de diepte van licht penetratie verhoogt en de fototoxiciteit vermindert tijdens Live Imaging experimenten¹⁰. Met behulp van deze instellingen hebben we met succes Live Imaging experimenten uitgevoerd op Lnv’s voor meer dan 30 minuten zonder de duidelijke morfologische verslechtering van het neuron te observeren. Bovendien hebben genetische manipulaties met behulp van de flip-out techniek ons in staat om de individuele lnv’s te labelen met een membraan gelabeld GFP, dat ook cruciaal is voor het bewaken van de bewegingen van individuele takken^11,12,13 .

Om het dynamische gedrag van alle takken op de LNv dendritische Arbor met optimale optische resolutie vast te leggen, hebben we time-lapse 3D-beeldvorming uitgevoerd op vers ontleed larvale hersen explanten met een hoge ruimtelijke resolutie op 1 min per frame voor 10 tot 30 min. ontwikkelen van LNv dendrites zijn zeer dynamisch, met een groot percentage van de takken weergegeven waarneembare veranderingen binnen de 10 min venster. Dit leidt tot een van de belangrijkste technische uitdagingen bij het bestuderen van dendriet-dynamiek, het kwantificeren van vertakkings gedrag op basis van de 4D-beeldgegevens sets. Eerder vastgestelde methoden hebben verschillende beperkingen, waaronder gebrek aan nauwkeurigheid en buitensporige tijd vereiste. Daarom hebben we een semi-automatische methode ontwikkeld die de nabewerking van afbeeldingen, handmatige markering van de aftakkingen van de filialen en automatische 4D-spot tracering met behulp van een afbeelding aantekening software combineert. We berekenen de bewegingen van de filialen op verschillende tijdstippen op basis van de 3D-coördinaten van de spots. De gegevens worden vervolgens geëxporteerd en geanalyseerd om kwantitatieve metingen van de vertakkings dynamiek te produceren. Deze methode beoordeelt nauwkeurig de duur en omvang van de uitbreiding en terugtrekking gebeurtenissen van bestaande takken, evenals de vorming van nieuwe takken, waardoor we de dendriet dynamiek in een groot aantal neuronen bewaken.