Affichage bactérien de Peptide pour la sélection des enzymes de biotinylating de roman

La biotinylation d’une protéine crée une étiquette puissante pour son isolement et sa détection d’affinité. La biotinylation des protéines enzymatiques est une modification post-traduction très spécifique catalysée par des ligases biotine-protéines. La ligase de biotine-protéine E. coli BirA est extrêmement spécifique et ne biotinylates covalently qu’un nombre restreint de protéines naturelles à des résidus spécifiques de lysine¹. Les avantages de la biotinylation catalysée De BirA sont actuellement exploités en fusionnant la protéine cible avec un petit peptide synthétique de biotine de biotine à 15 amino-acides (AP) qui est effectivement biotinylated² et permet le très spécifique et biotinylation efficace in vivo et in vitro par co-expression ou ajout de BirA^3,4,5. Bien que la ligature biotine-protéine catalysée in vivo et in vitro de BirA soit une stratégie d’étiquetage attrayante, son application se limite aux échantillons qui contiennent des protéines fusionnées par ap. Le but de cette méthode est le développement de nouveaux mutants de ligases biotine-protéine qui biotinylate sélectivement protéines indigènes non modifiées et, ce faisant, augmenter le nombre d’applications dans lesquelles la stratégie de biotinylation enzymatique peut être utilisé.

La fonction protéique peut être évoluée par des cycles itératifs de la mutation, de la sélection et de l’amplification des variantes génétiques avec la fonction désirée. Une stratégie de sélection forte et efficace est cruciale pour l’évolution dirigée et l’activité de ligase biotine-protéine est facilement sélectionnée en raison de la forte liaison entre la biotine et la streptavidine et ses homologs⁶. Les technologies d’affichage des phages permettent la sélection de phages qui présentent des peptides biotinylated^7,8. Puisque l’amplification des phages isolés exige l’infection d’un hôte bactérien, cependant, la sélection de phage avec la streptavidine crée un goulot d’étranglement en ce que la liaison à haute affinité de la biotine à la streptavidine est pratiquement irréversible sous non-dénaturation Conditions. Pour assurer la liaison réversible des phages biotinylated, les avidins monomeric avec l’affinité inférieure ont été employés qui ont eu comme conséquence un modeste enrichissement de 10 fois^7. Nous avons récemment développé une méthode d’affichage bactérien pour l’isolement des nouvelles variantes BirA qui élimine la nécessité de l’élution de la matrice d’affinité et élimine ainsi un goulot d’étranglement des systèmes de sélection BirA précédents⁹. En effet, notre système d’affichage bactérien permet un enrichissement de clones actifs en une seule étape de sélection^9,offrant ainsi un système de sélection efficace pour l’évolution dirigée de nouvelles variantes de BirA.

Notre système d’affichage bactérien se compose de deux composants, BirA avec une étiquette C-terminal 6xHis et une protéine d’échafaudage qui permet l’affichage de surface d’un peptide cible. Nous avons utilisé la protéine d’échafaudage augmentée circulairement permutée protéine de membrane externe X (eCPX) puisque l’affichage efficace des peptides peut être observé à la fois à la N- et C-termini^10,11. La fusion de la séquence de peptide cible au terminus C de l’eCPX assure la biotinylation des bactéries exprimant des variantes actives de BirA. Les bactéries permettent la sélection efficace de streptavidin que le peptide biotinylated affiche maintenant sur la surface (figure 1a).

Le but de cette méthode est de sélectionner pour de nouvelles variantes de BirA qui biotinylates séquences peptidiques présentes dans les protéines indigènes. Le système est encodé par des gènes présents sur le plasmique pBAD-BirA-eCPX-AP, qui contient un promoteur arabinose-inductible contrôlant BirA (araBAD), et un promoteur T7 contrôlant eCPX⁹ (Figure 1b). Le protocole actuel décrit la procédure détaillée pour 1) l’incorporation d’un peptide dérivé d’une protéine cible dans le C-terminal d’eCPX, 2) la création d’une bibliothèque mutationnelle de BirA par PCR sujette aux erreurs, 3) sélection de bactéries liant la streptavidine par tri cellulaire activé magnétique (MACS), 4) quantification de l’enrichissement des bactéries et 5) caractérisation initiale des clones isolés.