淡水ムール貝の生殖状態と幼虫発達を特徴付けるための非致死的方法の標準化(ビバルビア:ユニオンダ)

1. グラビッド女性コレクション 注:魚類野生生物サービスの淡水ムール調査プロトコル33を参照して、絶滅危惧種のサンプリングサイトを適切に調査する方法について説明してください。適切な連邦許可は、存在するすべての種の保護された種と州の許可のフィールドコレクションの前に取得する必要があります。 触覚的な方法(ステップ1.2)を使用してフィールドから生きているイガイを収集するか、博物館から保存された標本を利用します(ステップ1.3)。注:乾燥を防ぎ、ストレスを軽減するために、コレクション後に生きているムール貝を涼しく濡らし続けることが重要であり、グラビッドムール貝の最小限の取り扱いは、女性が早期にエラの内容を放出するのを避けるために重要です34。 女性の重力を評価するコレクション中の目視検査(例えば、マントルルアーレの存在、コングルティナテスなど)または収集後の目視検査(例えば、内側を見て、エラが膨張しているかどうかを確認するのに十分な開いている弁を優しくこじ開く)によって、図 1)注:種は、時には2つの外側のエラ(外皮)、2つの内側のエラ(内枝)、または4つのエラ(四面体)すべてがマルシャル17である場合もあるので、グロチジアがマルシャルエラ内でどのように羽ばたくかによって異なります。プロトコルはここで一時停止することができ、灰色の女性はギルサンプリングのためにラボに戻って輸送することができます。 図1:優しく覗く個人が開きます。生きているムール貝の重力を確認するには、親指(A)でバルブを優しく開くか、慎重にバルチを開くために鏡やリバースペンチを使用します(B)。この方法に関連する注意事項については、プロトコルの手順 2.3 を確認してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 保存された標本に対して、バルブを開き、エラを検査して、個体が重力メスであるかどうかを判断して目視検査を行います(図2)。 図2:グラビッドな女性を識別する方法。メスのムール貝の雄鶏のエラは、女性がグラビディとうねっているときに膨張して表示されます。写真AとCは横の視点からエラを示し、写真BとDはエラの腹部の眺めを提供する。赤いボックスは、グラビッド(A/B)とグラビッド(C/D)メスのランプシリス・ストラミニア・ムール貝の違いを強調するためにエラの輪郭を描きます。個人の総長は79のmm (A/B)および88のmm (C/D)である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 2. ギルコンテンツサンプリング 注:このプロトコルは、サンプリングがフィールドと実験室の生きたイガイに、または保存された標本で起こるかどうかに適合させることができます。 採取後24時間以内にサンプル評価が行われない場合、またはエラの場合は、抽出35またはエタノール(EtOH)の24時間以内にエラの内容物が評価される場合、滅菌水の約1mLのプラスチックマイクロ遠心分離管を準備する内容はEtOHに保存されている博物館の標本からです。グロチディアが走査型電子顕微鏡(SEM)イメージング用である場合は、70%EtOHを使用し、グロチディアが遺伝子検査に使用される場合は、非変性95%EtOH36を使用する。 10 mLシリンジ上の無菌20Gベベル先端針の紙包装を取り外します。キャップを外して針を露出させ、1.5 mLのプラスチックチューブを用意してギル含有量を収集します。黒いストッパーが0 mL/ccラインにあるように、シリンジのハンドルをずっと下に押します。注:生殖不能の注射器は、ギルの内容物がサンプリングされるたびに使用する必要があります。使用済みのシリンジは、先端を10%の漂白液に浸し、1mLの滅菌水で充填し、プランジャーを0mL/ccに戻してシンジをすすいで、最後に清潔な布でシリンジを乾燥させ、現場で殺菌することができます。 グラビッドメスをピックアップし、親指の先端を使用して2つのバルブを静かに開きます。注意:動物に危害を加えないように注意してください。弁を広く開けるか速すぎると、内転筋の伸びが大きくなり、死亡率を引き起こす可能性があります。薄い貝殻の標本(例えば、アノドンタ、レプトデア、ウターバックリアなどの種)と若い個体は、このステップで特に脆弱です。壊れやすい貝殻の種を強制的に処理すると、殻を割り、死亡率を引き起こす可能性があります。場合によっては、前部および後部のシェルマージンから薄い殻の動物を絞り込み、腹部の表面を見ながら、シェルがわずかに屈曲し、ギャップを引き起こし、貝殻を観察したり、殻を開けたり、壊れやすいものを損傷することを防ぎます。シェルマージン。注:ツールは、このステップを支援するために使用することができますが、注意して使用しない場合は死亡率を引き起こす可能性があり、可能な限り避ける必要があります。例えば、鏡面または変更されたリバースペンチのセットは、個々の開いたままにするのを助けるために使用され、くさびはバルブを開く支柱を助けるために使用することができます。これらの器具は、他の人が助けるために利用可能である場合(すなわち、ある人が動物を開いたまま、別の人が抽出用の注射器を操縦する)必要とされない場合があります。マントル組織をペリオストラカムから損傷または分離すると、成長変形および死亡率37を引き起こす可能性があります。したがって、マントル組織とシェルの外側のマージンとの間の接続を切断しないようにすることが重要です。 注射器の針先を使用して、膨張したマーシャルギルの単一の水管を穏やかに貫通します。次に、針のベベ先端を利用して、エラの内容物をそっとすくい取ります。注:ギルの内容物は、通常、針のベベの先端に表示されるべき乳白色の一貫性を有する。 顕微鏡が容易に入手可能な場合は、注射器の内容物をペトリ皿に直接堆積します。それ以外の場合は、後で評価するために、指定された液体(ステップ2.1を参照)で1.5 mLプラスチックマイクロ遠心管に内容物を保管してください。注:損傷を避け、生存率を低下させるために輸送中のグロチディアサンプルの妨害および取り扱いを最小限に抑える32、35。 属種の同定、重力状態、女性の長さ(mm)、コレクターと連絡先情報、状態、郡、排水、特定の収集場所、緯度と経度、ギルの一意の識別子に関する情報を記録します。サンプル、調査サイトの一意の識別子、およびギルの内容が抽出された場合の収集日 (図 3)。各収集船舶に一意の識別子を記録し、輸送中に正確なデータ記録を確保します。 アイデンティティ検証のためにムール貝の外側の右弁を撮影し、画像に読みやすい一意の識別子でラベル付けされたチューブを含めます。必要に応じて、ムール貝が見つかった環境とコミュニティに関する情報を補完するために、他のアバイオティクスおよび生物学的パラメータを収集します(提案については図3を参照)。 図 3: フィールド重力データシートの例。信頼性の高い情報を生成するためにギルサンプルを採取する場合は、正確なデータレポートが必要です。これは、各ギルサンプルと共に収集する最小フィールドと余分なアバイオティックパラメータを含むフィールドデータシートの例です。詳細については、プロトコルの手順 4.1 を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 3. エラ内容の実験室評価 エラの内容物が1.5mLのチューブに入っている場合は、ペトリ皿に移し、皿の底を水で満たします。ペトリ皿を円形にゆっくりと旋回し、皿の中央に内容物を集め、サンプルをより集中的に見ることができます。注:1.5 mLチューブは、エラの内容物がチューブの壁に付着している場合は、噴出ボトルを使用して洗い流すか、水で満たされたピペットを転送する必要があります。 ペトリ皿を解剖顕微鏡の下に置き、サンプルを評価します。可能であれば、顕微鏡下でエラサンプルの写真を撮り、そのサンプルの一意の識別子でラベルを付けます。 各エラサンプルにどの発生段階が存在するかを記録します。図 4をガイドとして使用して、各開発段階を特徴付ける。いくつかのケースでは、女性は、複数の発達段階で幼虫をむち維にしている可能性があります。したがって、特定のサンプル内で観察されたすべての発達段階(例えば、EGG/DG/IMG/FDG)を報告する。保存されたグロチジアが評価されたら、セクション4に進みます。完全に発達したグロチジアが同定され、EtOHが保存に使用されなかった場合は、ステップ3.3に進みます。注:卵、卵塊。DG, グロチジアを開発;IMG, 未熟なグロチジア;FDG、完全に開発されたグロチジア。 図4:マルシャルエラにおけるグロチジア発達の様々な段階の表現。(A)卵塊(EGG)は卵をまとめる膜を持っている。各卵膜の中には、分化細胞の不透明な球状質量があります。不透明な球状質量は、初期の細胞分裂中に複数の球状質量に分割される可能性がありますが、明確な二枚貝の形状が観察されるまでEGGとして記録する必要があります。(B)未熟なグロチジア(IMG)は、卵膜内に含まれる明確な二枚貝状の塊を有する。(C)グロチジア(DG)の発症は、明確な二枚貝の形状、卵膜なし、および内部の組織化されていない組織を持ち、しばしば見た目があいまいである。Glochidia(DG)の開発は、NaClに曝露された場合には反応せず、データが記録されたときに「DG(T)」に分類されます。(D)完全に発達したグロチジア(FDG)は、明確な二枚貝の形状と明らかな付加筋組織を有し、グロチジアを閉じ込めることを可能にする。完全に発達したグロチジア(FDG)は、保存後に2つの開口弁として観察されることが多い。NaClにさらされ、「FDG(T)」に分類される場合、2つの開いている弁は通常、閉じたり、開閉したりしてスナップします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 塩化ナトリウム(NaCl)試験を実施し、エラ試料35のサブセット液滴にNaClの結晶を添加して完全に発達したグロチジアの生存率をさらに評価する。実行可能なグロチディアは、開いている位置から弁を閉じることによってNaClに応答します。データが記録されるときに、指定の最後に ‘(T)’ を含む塩分テスト済みのグロチディアを報告します。注:完全に発達したグロチジアはまた、NaClにさらされることなく開閉を積極的にスナップして観察されてもよい。 4. データベースへの報告 オンラインソフトウェアプログラム38、39、40を使用して開発されたFMGAウェブ(http://arcg.is/089uee)にアクセスします。FMGA ページには、デスクトップ データ入力フォームへのリンクと、モバイル デバイス用のアプリケーションのダウンロードが表示されます。モバイル アプリは、フィールド内のデータ入力と自動ジオリファレンス41を有効にします。注:淡水ムール貝種の生命史イベントに関連する重力カレンダーや他のグラフィックスもFMGAダッシュボードで見つけることができます。 モバイル アプリまたはデスクトップ サイトを使用して、ドロップダウン メニューとテキスト入力フィールドを使用して、データ入力フォームに結果を記録します。大規模な既存のデータセットの場合は、テンプレート スプレッドシートの作成者に問い合わせてください。適切な列見出しの下に記録されたデータを入力し、スプレッドシート上の各レコードまたは行が、1 人のグラビッド個人からのギル サンプルの観測値を表していることを念頭に置いてください。 結果を送信すると、管理者によって検証された後に FMGA データベースに追加されます。注: データが FMGA データベースで検証およびコンパイルされると、FMGA ダッシュボードに表示されるすべてのグラビティ カレンダーやその他のインタラクティブグラフィックスが更新されます。