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Biologia do Desenvolvimento

Détermination des relations d’auto et d’intercompatibilité dans les a abricots combinant la pollinisation manuelle, la microscopie et les analyses génétiques

Published: June 16, 2020
doi:
10.3791/60241
, , ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM La Mayora-UMA-CSIC)

Summary

Nous présentons une méthodologie pour établir les exigences de pollinisation des cultivarsd’abricot (Prunus armeniaca L.) combinant la détermination de l’auto-compatibilité par microscopie de fluorescence avec l’identification du S-génotype par analyse pcr.

Abstract

L’autocompatibilité dans rosaceae est déterminée par un système d’auto-incompatibilité gametophytique (GSI) qui est principalement contrôlé par le locus multiallelique S. Dans l’abricot, la détermination des relations d’auto-compatibilité et d’intercompatibilité est de plus en plus importante, puisque la libération d’un nombre important de nouveaux cultivars a entraîné l’augmentation des cultivars ayant des exigences de pollinisation inconnues. Ici, nous décrivons une méthodologie qui combine la détermination de l’auto-compatibilité par pollinisation manuelle et microscopie avec l’identification du génotype Spar l’analyse pcr. Pour la détermination de l’auto-compatibilité, les fleurs à l’étape du ballon de chaque cultivar ont été recueillies dans le champ, pollinisées à la main en laboratoire, fixes et tachées de bleu aniline pour l’observation du comportement du tube pollin sous la microscopie de fluorescence. Pour l’établissement de relations d’incompatibilité entre les cultivars, Sl’ADN de chaque cultivar a été extrait de jeunes feuilles et S-allèles ont été identifiés par PCR. Cette approche permet d’établir des groupes d’incompatibilité et d’élucider les relations d’incompatibilité entre les cultivars, ce qui fournit une information précieuse pour choisir les pollinisateurs appropriés dans la conception de nouveaux vergers et pour sélectionner les parents appropriés dans les programmes d’élevage.

Introduction

L’autocompatibilité est une stratégie des plantes à fleurs pour prévenir l’autopollinisation et promouvoir la croisement1. Dans rosaceae, ce mécanisme est déterminé par un système d’auto-incompatibilité gametophytique (GSI) qui est principalement contrôlé par le locus multiallelique S2. Dans le style, le gène RNase code le déterminant sylar S-s,un RNase3, tandis qu’une protéine F-box, qui détermine le déterminant du pollen S,est codifiée par le gène4de la SFB . L’interaction d’auto-incompatibilité a lieu par l’inhibition de la croissance du tube pollinique le long du style empêchant la fertilisation de l’ovule5,6.

En abricot, un renouvellement variétal a eu lieu dans le monde entier au cours des deux dernières décennies7,8. Cette introduction d’un nombre important de nouveaux cultivars, provenant de différents programmes d’élevage publics et privés, a entraîné l’augmentation des cultivars d’abricots ayant des besoins inconnus de pollinisation8.

Différentes méthodologies ont été utilisées pour déterminer les exigences de pollinisation dans l’abricot. Sur le terrain, la compatibilité de soi peut être établie par des pollinisations contrôlées dans des arbres en cage ou dans des fleurs émasculées et en enregistrant par la suite le pourcentage de fruits ensemble9,10,11,12. En outre, des pollinisations contrôlées ont été effectuées en laboratoire par culture semi-in vivo des fleurs et l’analyse du comportement du tube pollinique sous microscopie de fluorescence8,13,14,15,16,17. Récemment, les techniques moléculaires, telles que l’analyse et le séquençage du PCR, ont permis la caractérisation des relations d’incompatibilité basées sur l’étude des gènes RNase et SFB 18,19. En abricot, trente-trois S-allèles ont été signalés (S1 à S20, S22 à S30, S52, S53, Sv, Sx), y compris un allèle lié à l’auto-compatibilité (Sc)12,18,20,21,22,23,24. Jusqu’à présent, 26 groupes d’incompatibilité ont été stablis dans cette espèce selon le S-génotype8,9,17,25,26,27. Les cultivars avec les mêmes allèles Ssont inter-incompatibles, tandis que les cultivars avec au moins un S-allèledifférent et, par conséquent, répartis dans différents groupes incompatibles, sont intercompatibles.

Pour définir les exigences de pollinisation des cultivars d’abricots, nous décrivons une méthodologie qui combine la détermination de l’auto-compatibilité par microscopie de fluorescence avec l’identification du génotype Spar analyse pcr dans les cultivars d’abricot. Cette approche permet d’établir des groupes d’incompatibilité et d’élucider les relations d’incompatibilité entre les cultivars.

Protocol

1. Détermination de la compatibilité autonome Goûtez les fleurs dans le champ. Il est nécessaire de recueillir les fleurs au stade du ballon ( Figure 1A), correspondant àl’étape58 sur l’échelle BBCH pour l’abricot28, pour éviter la pollinisation préalable non désirée. Autopollinisations en laboratoire Retirez les anths des fleurs au stade du ballon et placez-les sur un morceau de papier …

Representative Results

Les études de pollinisation de l’abricot nécessitent l’utilisation de fleurs au stade avancé du ballon un jour avant l’anthèse (Figure 1A). Cette étape est considérée comme la plus favorable à la fois pour la collection de pollen et de pistil, puisque les structures florales sont presque matures, mais la déhiscence anther n’a pas encore eu lieu. Cela empêche l’interférence du pollen indésirable, non seulement du pollen de la même fleur, mais aussi d’…

Discussion

Traditionnellement, la plupart des cultivars européens d’abricots commerciaux étaient auto-compatibles36. Néanmoins, l’utilisation de cultivars auto-incompatibles nord-américains comme parents dans les programmes d’élevage au cours des dernières décennies a entraîné la libération d’un nombre croissant de nouveaux cultivars auto-incompatibles ayant des exigences de pollinisation inconnues7,8,37…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par Ministerio de Ciencia, Innovacion y Universidades-European Regional Development Fund, Union européenne (AGL2016-77267-R, et AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (DFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón-European Social Fund, Union européenne (Grupo Consolidado A12_17R), Fundación Biodiversidad et Agroseguro S.A.

Materials

Agarose D1 Low EEO Conda 8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kit Bioline BIO-21060
Bright field microscope Leica Microsystems DM2500
CEQ System Software Beckman Coulter
DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN 69106
dNTP Set, 4 x 25 µmol Bioline BIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit – 400 Beckman Coulter 608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Beckman Coulter
GenomeLab Separation Buffer Beckman Coulter 608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1 Beckman Coulter 391438
HyperLadder 100bp Bioline BIO-33029
HyperLadder 1kb Bioline BIO-33025
Image Analysis System Leica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system  Bio-Rad 170-8640
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 13-400-518
pH-Meter BASIC 20 Crison
Phusion High-Fidelity PCR Kit Thermo Fisher Scientific F553S
Power Pack P 25 T Biometra
Primer Forward Isogen Life Science
Primer Reverse Isogen Life Science
Quantity One Software Bio-Rad
Stereoscopic microscope Leica Microsystems MZ-16
Sub-Cell GT Bio-Rad
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Taq DNA Polymerase QIAGEN 201203
Vertical Stand Autoclave JP Selecta
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Referências

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Self-compatibilityInter-compatibilityIncompatibilityApricotHand-pollinationMicroscopyGenetic AnalysisPollination RequirementsCultivar IdentificationIncompatibility GroupsSelf-incompatibilityFruit Tree CropsCherryPlumBBCH ScaleEmasculationPollen GerminationMicroscopyFixative SolutionEthanolPollen Germination MediumSodium SulfiteAutoclaving

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Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses. J. Vis. Exp. (160), e60241, doi:10.3791/60241 (2020).
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