JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia do Desenvolvimento

קביעת יחסי התאימות של העצמי והאינטר-(ב) משמש שילוב יד-האבקה, מיקרוסקופיה וניתוחים גנטיים

Published: June 16, 2020
doi:
10.3791/60241
, , ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM La Mayora-UMA-CSIC)

Summary

אנו מציגים מתודולוגיה להקמת הצרכים של האבקה של משמש (שזיף armeniaca L.) המשלבים את התאימות העצמית (in) של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית עם זיהוי של ה-S-גנוטיפ על ידי ניתוח PCR.

Abstract

אי-סבילות עצמית ב ורדיים נקבעת על ידי מערכת התאמה עצמית של Gamet Tic (GSI) כי הוא נשלט בעיקר על ידי multiallelic לוקוס S. בשמש, הקביעה של יחסי התאימות העצמית והבין (in) היא חשובה יותר ויותר, שכן שחרורו של מספר חשוב של זנים חדשים הביא לגידול זנים עם דרישות האבקה לא ידועות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת את ההגדרה של התאמה עצמית (בתוך) באמצעות המאביקים ומיקרוסקופ עם זיהוי של ה-S-גנוטיפ על ידי ניתוח PCR. בקביעת תאימות עצמית (in), הפרחים הנמצאים בשלב בלון מכל זנים נאספו בשדה, מואבקים בתוך המעבדה, קבועים ומוכתמים בכחול אנילין להתבוננות בהתנהגות שפופרת האבקה תחת המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית. להקמת יחסי התאמה בין זנים, דנ א מכל זנים הופק מעלים צעירים ו-S-alleles זוהו על ידי ה-PCR. גישה זו מאפשרת להקים קבוצות אי-תאימות ולהבהיר קשרי אי-תאימות בין זנים, המספקים מידע רב ערך לבחירת המאביקים המתאימים בעיצוב מטעים חדשים ולבחירת הורים מתאימים בתוכניות רבייה.

Introduction

אי-סבילות עצמית היא אסטרטגיה של צמחים פורחים כדי למנוע האבקה עצמית ולקדם את המעבר1. ב ורדיים, מנגנון זה נקבע על ידי מערכת התאמה עצמית של Gamet Tic (GSI) כי הוא נשלט בעיקר על ידי multiallelic לוקוס S2. בסגנון, הגן rnase מקודד את דטרמיננטה s-sטיילר, rnase3, בעוד חלבון בקופסה F, אשר קובע את הדטרמיננטה של אבקה, הוא מסווג על ידי גן sfb 4. האינטראקציה עצמית אי-תאימות מתרחשת דרך עיכוב של צמיחת שפופרת אבקה לאורך הסגנון מניעת הפריה של הביצית5,6.

בשמש, התקיימה התחדשות בין-שנים ברחבי העולם בשני העשורים האחרונים7,8. הקדמה זו של מספר גדול של זנים חדשים, מתוכניות הרבייה הציבוריות והפרטיות השונות, הביאה לגידול זנים משמשים בעלי דרישות האבקה לא ידועות8.

שיטות שונות שימשו לקביעת דרישות ההאבקה בשמש. בתחום, ניתן ליצור תאימות עצמית (in) על-ידי המאביקים מבוקרים בעצי בכלוב או בפרחים מסורס ולאחר מכן מקליטים את אחוז הפרי שהוגדר9,10,11,12. בנוסף, המאביקים מבוקרים בוצעו במעבדה על ידי vivo למחצה ב תרבות של פרחים וניתוח של התנהגות שפופרת אבקה תחת מיקרוסקופ הזריחה8,13,14,15,16,17. לאחרונה, טכניקות מולקולריות, כגון ניתוח PCR ורצף, הרשו לאפיון של קשרי אי-תאימות המבוססים על חקר הגנים של rnase ו- sfb 18,19. בשמש, 33 S-alleles דווחו (s1 עד S20, s22 אל s30, s52, s53, sv, sx), כולל alleles אחד הקשורים בתאימות עצמית (Sc)12,18,20,21,22,23,24. עד עכשיו, 26 קבוצות אי-סבילות הפכו לאורווה במין זה על פי ה- S-גנוטיפ8,9,17,25,26,27. זנים עם אותו ס-אללים הם בלתי-תואמים, בעוד שהזנים עם שינוי s-alleles אחד לפחות, וכתוצאה מכך, מוקצים בקבוצות שונות שאינן תואמות, הן תואמות.

כדי להגדיר את דרישות ההאבקה של זנים משמש, אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת את התאימות העצמית (בתוך) של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית עם זיהוי של ה-S-גנוטיפ על ידי ניתוח PCR בזנים משמש. גישה זו מאפשרת להקים קבוצות אי-תאימות ולהבהיר קשרי אי-תאימות בין זנים.

Protocol

1. קביעת תאימות עצמית (in) . לדגום את הפרחים בשדה יש צורך לאסוף את הפרחים בשלב הבלון (איור 1א), המתאים לשלב 58 בסולם bbch עבור משמש28, כדי למנוע האבקה קודמת לא רצויה. המאביקים במעבדה הסירו את האנונים של הפרחים על במת בלון ומניחים אותם ע…

Representative Results

לימודי האבקה בשמש דורשים שימוש בפרחים בשלב הבלון המאוחר יום לפני התזה (איור 1א). שלב זה נחשב לחיובי ביותר עבור האוסף האבקה והפיסטיל, שכן מבנים פרחוניים הם כמעט בוגרים, אבל הדחיניות עדיין לא התרחשה. זה מונע הפרעה של אבקה בלתי רצויה, לא רק של אבקה מאותו פרח אלא גם מפרחי…

Discussion

באופן מסורתי, זנים מסחריים משמשים באירופה היו בעלי תאימות עצמית36. למרות זאת, השימוש בזנים של צפון אמריקה בלתי-מתאימים לעצמי כהורים בתוכניות רבייה בעשורים האחרונים הביא לשחרורו של מספר גדל והולך של זנים חדשים שאינם תואמים לעצמי עם דרישות האבקה מוכרות7,<sup class…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי Ministerio de Ciencia, האוניברסיטה האירופית לפיתוח האזור האירופי, האיחוד האירופי (AGL2016-77267-R, ו AGL2015-74071-ג’ין); המכון הלאומי לשימור (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); הקרן האירופית למדעי החברה, האיחוד האירופי (גריפו באסדדו A12_17R), Biodiversidad, וAgroseguro דרום אמריקה

Materials

Agarose D1 Low EEO Conda 8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kit Bioline BIO-21060
Bright field microscope Leica Microsystems DM2500
CEQ System Software Beckman Coulter
DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN 69106
dNTP Set, 4 x 25 µmol Bioline BIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit – 400 Beckman Coulter 608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Beckman Coulter
GenomeLab Separation Buffer Beckman Coulter 608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1 Beckman Coulter 391438
HyperLadder 100bp Bioline BIO-33029
HyperLadder 1kb Bioline BIO-33025
Image Analysis System Leica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system  Bio-Rad 170-8640
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 13-400-518
pH-Meter BASIC 20 Crison
Phusion High-Fidelity PCR Kit Thermo Fisher Scientific F553S
Power Pack P 25 T Biometra
Primer Forward Isogen Life Science
Primer Reverse Isogen Life Science
Quantity One Software Bio-Rad
Stereoscopic microscope Leica Microsystems MZ-16
Sub-Cell GT Bio-Rad
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Taq DNA Polymerase QIAGEN 201203
Vertical Stand Autoclave JP Selecta
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Silva, N. F., Goring, D. R. Mechanisms of self-incompatibility in flowering plants. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, 1988-2007 (2001).
  2. Charlesworth, D., Vekemans, X., Castric, V., Glémin, S. Plant self-incompatibility systems: A molecular evolutionary perspective. New phytologist. 168, 61-69 (2005).
  3. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38, 304-311 (1997).
  4. Ushijima, K., et al. Structural and transcriptional analysis of the self-incompatibility locus of almond: Identification of a pollen-expressed F-box gene with haplotype-specific polymorphism. The Plant cell. 15, 771-781 (2003).
  5. Bedinger, P. A., Broz, A. K., Tovar-Mendez, A., McClure, B. Pollen-Pistil Interactions and Their Role in Mate Selection. Plant Physiology. 173, 79-90 (2017).
  6. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: A review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  7. Zhebentyayeva, T., Ledbetter, C., Burgos, L., Llacer, G., Badenes, M. L., Byrne, D. Apricot. Fruit Breeding. , 415-458 (2012).
  8. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing Production in the New Generation of Apricot Cultivars: Self-incompatibility, S-RNase Allele Identification, and Incompatibility Group Assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
  9. Egea, J., Burgos, L. Detecting Cross-incompatibility of Three North American Apricot Cultivars and Establishing the First Incompatibility Group in Apricot. Journal of the American Society for Horticultural Science. 121, 1002-1005 (1996).
  10. Rodrigo, J., Herrero, M. Effects of pre-blossom temperatures on flower development and fruit set in apricot. Scientia Horticulturae. 92, 125-135 (2002).
  11. Julian, C., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower bud differentiation and development in fruiting and non-fruiting shoots in relation to fruit set in apricot (Prunus armeniaca). Trees. 24, 833-841 (2010).
  12. Muñoz-Sanz, J. V., Zuriaga, E., López, I., Badenes, M. L., Romero, C. Self-(in)compatibility in apricot germplasm is controlled by two major loci, S and M. BMC Plant Biology. 17, 82 (2017).
  13. Burgos, L., Berenguer, T., Egea, J. Self- and Cross-compatibility among Apricot Cultivars. HortScience. 28, 148-150 (1993).
  14. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot “Moniqui”. Journal of Horticultural Science. 71, 801-805 (1996).
  15. Milatović, D., Nikolić, D., Krška, B. Testing of self-(in)compatibility in apricot cultivars from European breeding programmes. Horticultural Science. 40 (2), 65-71 (2013).
  16. Milatović, D., Nikolić, D., Fotirić-Aksić, M., Radović, A. Testing of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Acta Scientiarum Polonorum, Hortorum Cultus. 12 (6), 103-113 (2013).
  17. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of Self-Incompatibility Alleles by Specific PCR Analysis and S-RNase Sequencing in Apricot. Int J Mol Sci. 19, 3612 (2018).
  18. Romero, C., et al. Analysis of the S-locus structure in Prunus armeniaca L. Identification of S-haplotype specific S-RNase and F-box genes. Plant Molecular Biology. 56, 145-157 (2004).
  19. Halász, J., Pedryc, A., Hegedus, A. Origin and dissemination of the pollen-part mutated SC haplotype which confers self-compatibility in apricot (Prunus armeniaca). New Phytologist. 176, 792-803 (2007).
  20. Halász, J., Hegedus, A., Hermán, R., Stefanovits-Bányai, &. #. 2. 0. 1. ;., Pedryc, A. New self-incompatibility alleles in apricot (Prunus armeniaca L.) revealed by stylar ribonuclease assay and S-PCR analysis. Euphytica. 145, 57-66 (2005).
  21. Vilanova, S., Romero, C., Llacer, G., Badenes, M. L., Burgos, L. Identification of Self-(in)compatibility Alleles in Apricot by PCR and Sequence Analysis. Journal of the American Society for Horticultural Science. 130, 893-898 (2005).
  22. Feng, J., et al. Detection and transcript expression of S-RNase gene associated with self-incompatibility in apricot (Prunus armeniaca L.). Molecular Biology Reports. 33, 215-221 (2006).
  23. Zhang, L., et al. Identification of self-incompatibility (S-) genotypes of Chinese apricot cultivars. Euphytica. 160, 241-248 (2008).
  24. Wu, J., et al. Identification of S-haplotype-specific S-RNase and SFB alleles in native Chinese apricot (Prunus armeniaca L). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 84, 645-652 (2009).
  25. Szabó, Z., Nyéki, J. Blossoming, fructification and combination of apricot varieties. Acta Horticulturae. 293, 295-302 (1991).
  26. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K. U., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135, 410-417 (2010).
  27. Lachkar, A., et al. Identification of self-(in)compatibility S-alleles and new cross-incompatibility groups in Tunisian apricot (Prunus armeniaca L.) cultivars. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 88, 497-501 (2013).
  28. Pérez-Pastor, A., Ruiz-Sánchez, M. C., Domingo, R., Torrecillas, A. Growth and phenological stages of Búlida apricot trees in South-East. Agronomie. 24, 93-100 (2004).
  29. Williams, J. H., Friedman, W. E., Arnold, M. L. Developmental selection within the angiosperm style: using gamete DNA to visualize interspecific pollen competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 9201-9206 (1999).
  30. Julian, C., Herrero, M., Rodrigo, J. Anther meiosis time is related to winter cold temperatures in apricot (Prunus armeniaca L.). Environmental and Experimental Botany. 100, 20-25 (2014).
  31. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A., Rodrigo, J. Lack of Fruit Set Caused by Ovule Degeneration in Japanese Plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  32. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower Emasculation as the Cause for Lack of Fruit Set in Japanese Plum Crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  33. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  34. Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil Starch Reserves at Anthesis Correlate with Final Flower Fate in Avocado (Persea americana). PLOS ONE. 8 (10), 78467 (2013).
  35. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through Identification, Characterization and cDNA cloning for S-RNases in Sweet Cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124, 224-233 (1999).
  36. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science. 72, 147-154 (1997).
  37. Hormaza, J. I., Yamane, H., Rodrigo, J., Kole, C. Apricot. Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants, Volume 4 Fruits and Nuts. , 171-187 (2007).
  38. Benmoussa, H., Ghrab, M., Ben Mimoun, M., Luedeling, E. Chilling and heat requirements for local and foreign almond (Prunus dulcis Mill.) cultivars in a warm Mediterranean location based on 30 years of phenology records. Agricultural and Forest Meteorology. 239, 34-46 (2017).
  39. Rodrigo, J., Herrero, M., Hormaza, J. I. Pistil traits and flower fate in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Applied Biology. 154, 365-375 (2009).
  40. Williams, R. R., Williams, R. R., Wilson, D. Techniques used in fruit-set experiments. Towards Regulated Cropping. , 57-61 (1970).
  41. Sutherland, B. G., Robbins, T. P., Tobutt, K. R. Primers amplifying a range of Prunus S-alleles. Plant Breeding. 123, 582-584 (2004).
  42. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8, 4321-4325 (1980).
  43. Porebski, S., Bailey, L. G., Baum, B. R. Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol Components. Plant Molecular Biology Reporter. 15 (1), 8-15 (1997).
  44. Rogers, S. O., Bendich, A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology. 5 (2), 69-76 (1985).
  45. Hormaza, J. I. Molecular characterization and similarity relationships among apricot (Prunus armeniaca L.) genotypes using simple sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics. 104, 321-328 (2002).
  46. Sonneveld, T., Tobutt, K. R., Robbins, T. P. Allele-specific PCR detection of sweet cherry self-incompatibility (S) alleles S1 to S16 using consensus and allele-specific primers. Theoretical and Applied Genetics. 107, 1059-1070 (2003).
  47. Hegedus, A., Lénárt, J., Halász, J. Sexual incompatibility in Rosaceae fruit tree species: molecular interactions and evolutionary dynamics. Biologia Plantarum. 56 (2), 201-209 (2012).
  48. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  49. Company, R. S. i., Kodad, O., Martí, A. F. i., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: From deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  50. Boskovic, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  51. Cachi, A. M., Wünsch, A. S-genotyping of sweet cherry varieties from Spain and S-locus diversity in Europe. Euphytica. 197 (2), 229-236 (2014).
  52. Zuriaga, E., et al. An S-locus Independent Pollen Factor Confers Self-Compatibility in “Katy” Apricot. PLoS ONE. 8 (1), 53947 (2013).

Tags

Self-compatibilityInter-compatibilityIncompatibilityApricotHand-pollinationMicroscopyGenetic AnalysisPollination RequirementsCultivar IdentificationIncompatibility GroupsSelf-incompatibilityFruit Tree CropsCherryPlumBBCH ScaleEmasculationPollen GerminationMicroscopyFixative SolutionEthanolPollen Germination MediumSodium SulfiteAutoclaving

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses. J. Vis. Exp. (160), e60241, doi:10.3791/60241 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image