JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia do Desenvolvimento

Bepaling van zelf- en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in abrikoos die handbestuiving, microscopie en genetische analyses combineren

Published: June 16, 2020
doi:
10.3791/60241
, , ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM La Mayora-UMA-CSIC)

Summary

We presenteren een methodologie om de bestuivingsvereisten van abrikoos(Prunus armeniëca L.) cultivars vast te stellen die de bepaling van zelf-(in)compatibiliteit door fluorescentiemicroscopie combineren met de identificatie van het S-genotype door PCR-analyse.

Abstract

Zelf-incompatibiliteit in Rosaceae wordt bepaald door een Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) dat voornamelijk wordt gecontroleerd door de multiallelic locus S. In abrikoos wordt de bepaling van zelf- en inter-(in)compatibiliteitsrelaties steeds belangrijker, omdat het vrijkomen van een belangrijk aantal nieuwe cultivars heeft geleid tot de toename van cultivars met onbekende bestuivingsvereisten. Hier beschrijven we een methodologie die de bepaling van zelf-(in)compatibiliteit met handbestuivingen en microscopie combineert met de identificatie van het S-genotypedoor PCR-analyse. Voor zelf-(in)compatibiliteitsbepaling werden bloemen in het ballonstadium van elke cultivar verzameld in het veld, met de hand bestoven in het laboratorium, vast, en gekleurd met anilineblauw voor de observatie van pollenbuisgedrag onder de fluorescentiemicroscopie. Voor het tot stand brengen van onverenigbaarheidsrelaties tussen cultivars werd DNA van elke cultivar uit jonge bladeren gehaald en werden S-allelesgeïdentificeerd door PCR. Deze aanpak maakt het mogelijk om incompatibiliteitsgroepen vast te stellen en incompatibiliteitsrelaties tussen cultivars op te helderen, wat een waardevolle informatie biedt om geschikte bestuivers te kiezen bij het ontwerpen van nieuwe boomgaarden en om geschikte ouders in fokprogramma’s te selecteren.

Introduction

Zelf-incompatibiliteit is een strategie van bloeiende planten om zelfbestuiving te voorkomen en outcrossing te bevorderen1. In Rosaceae wordt dit mechanisme bepaald door een Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) dat voornamelijk wordt gecontroleerd door de multiallelic locus S2. In de stijl codeert het RNase-gen de S-stylar determinant, een RNase3, terwijl een F-box eiwit, dat de S-pollendeterminant bepaalt, wordt gecodificeerd door het SFB-gen 4. De zelf-onverenigbaarheid interactie vindt plaats door de remming van pollen buis groei langs de stijl het voorkomen van de bevruchting van de ovule5,6.

In abrikoos, een ras vernieuwing heeft plaatsgevonden wereldwijd in de afgelopen twee decennia7,8. Deze introductie van een belangrijk aantal nieuwe cultivars, uit verschillende publieke en private veredelingsprogramma’s, heeft geresulteerd in de toename van abrikozencultivanten met onbekende bestuivingsvereisten8.

Verschillende methoden zijn gebruikt om de bestuivingsvereisten in abrikoos te bepalen. In het veld kan zelf-(in)compatibiliteit worden vastgesteld door gecontroleerde bestuivingen in gekooide bomen of in ontlaste bloemen en vervolgens het percentage fruitset9,10,,11,12registreren . Bovendien zijn in het laboratorium gecontroleerde bestuivingen uitgevoerd door een semi-in vivo bloementeelt en analyse van het gedrag van de pollenbuis onder fluorescentiemicroscopie8,13,14,15,16,17. Onlangs hebben moleculaire technieken, zoals PCR-analyse en sequencing, de karakterisering van onverenigbaarheidsrelaties mogelijk gemaakt op basis van de studie van de RNase- pt SFB-genen 18,19. In abrikoos zijn drieëndertig S-allelen gemeld (S1 tot S20, S22 tot S30, S52, S53, Sv, Sx), inclusief één allel in verband met zelfcompatibiliteit (Sc)12,18,20,21,22,23,24. Tot nu toe zijn 26 onverenigbaarheidsgroepen bij deze soort ge stablished volgens het S-genotype S8,9,,17,25,26,27. Cultivars met Sdezelfde S-allelen zijn onderling onverenigbaar, terwijl cultivars met ten minste één verschillend S-allelen bijgevolg in verschillende onverenigbare groepen intercompatibel zijn.

Om de bestuivingsvereisten van abrikozencultivivars te definiëren, beschrijven we een methodologie die de bepaling van zelf-(in)compatibiliteit door fluorescentiemicroscopie combineert met de identificatie van het S-genotype door PCR-analyse in abrikozencultivivars. Deze aanpak maakt het mogelijk om incompatibiliteitsgroepen vast te stellen en incompatibiliteitsrelaties tussen cultivars op te helderen.

Protocol

1. Zelf-(in)compatibiliteitsbepaling Proef de bloemen in het veld. Het is noodzakelijk om de bloemen te verzamelen op ballonstadium(figuur 1A), overeenkomend met fase 58 op de BBCH-schaal voor abrikoos28, om ongewenste eerdere bestuiving te voorkomen. Zelf- en kruisbestuivingen in het laboratorium Verwijder de anthers van de bloemen op ballon stadium en leg ze op een stuk papier te drogen op laboratorium…

Representative Results

Bestuivingsstudies bij abrikoos vereisen het gebruik van bloemen in het late ballonstadium een dag voor de anthese(figuur 1A). Deze fase wordt beschouwd als de meest gunstige voor zowel stuifmeel en stamper collectie, omdat florale structuren zijn bijna volwassen, maar anther dehiscence is nog niet opgetreden. Dit voorkomt de interferentie van ongewenste pollen, niet alleen van stuifmeel van dezelfde bloem, maar ook van andere bloemen, omdat de gesloten bloemblaadjes de koms…

Discussion

Traditioneel, de meeste commerciële abrikozen Europese cultivars waren zelf-compatibel36. Niettemin heeft het gebruik van Noord-Amerikaanse zelfonverenige cultivars als ouders in fokprogramma’s in de afgelopen decennia geresulteerd in de release van een toenemend aantal nieuwe zelfonverenige cultivars met onbekende bestuivingsvereisten7,8,37. Zo wordt de bepaling van zelf- en inter-(in)compatibiliteitsre…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gefinancierd door Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-European Regional Development Fund, European Union (AGL2016-77267-R en AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón-Europees Sociaal Fonds, Europese Unie (Grupo Consolidado A12_17R), Fundación Biodiversidad en Agroseguro S.A.

Materials

Agarose D1 Low EEO Conda 8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kit Bioline BIO-21060
Bright field microscope Leica Microsystems DM2500
CEQ System Software Beckman Coulter
DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN 69106
dNTP Set, 4 x 25 µmol Bioline BIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit – 400 Beckman Coulter 608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Beckman Coulter
GenomeLab Separation Buffer Beckman Coulter 608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1 Beckman Coulter 391438
HyperLadder 100bp Bioline BIO-33029
HyperLadder 1kb Bioline BIO-33025
Image Analysis System Leica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system  Bio-Rad 170-8640
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 13-400-518
pH-Meter BASIC 20 Crison
Phusion High-Fidelity PCR Kit Thermo Fisher Scientific F553S
Power Pack P 25 T Biometra
Primer Forward Isogen Life Science
Primer Reverse Isogen Life Science
Quantity One Software Bio-Rad
Stereoscopic microscope Leica Microsystems MZ-16
Sub-Cell GT Bio-Rad
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Taq DNA Polymerase QIAGEN 201203
Vertical Stand Autoclave JP Selecta
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Silva, N. F., Goring, D. R. Mechanisms of self-incompatibility in flowering plants. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, 1988-2007 (2001).
  2. Charlesworth, D., Vekemans, X., Castric, V., Glémin, S. Plant self-incompatibility systems: A molecular evolutionary perspective. New phytologist. 168, 61-69 (2005).
  3. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38, 304-311 (1997).
  4. Ushijima, K., et al. Structural and transcriptional analysis of the self-incompatibility locus of almond: Identification of a pollen-expressed F-box gene with haplotype-specific polymorphism. The Plant cell. 15, 771-781 (2003).
  5. Bedinger, P. A., Broz, A. K., Tovar-Mendez, A., McClure, B. Pollen-Pistil Interactions and Their Role in Mate Selection. Plant Physiology. 173, 79-90 (2017).
  6. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: A review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  7. Zhebentyayeva, T., Ledbetter, C., Burgos, L., Llacer, G., Badenes, M. L., Byrne, D. Apricot. Fruit Breeding. , 415-458 (2012).
  8. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing Production in the New Generation of Apricot Cultivars: Self-incompatibility, S-RNase Allele Identification, and Incompatibility Group Assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
  9. Egea, J., Burgos, L. Detecting Cross-incompatibility of Three North American Apricot Cultivars and Establishing the First Incompatibility Group in Apricot. Journal of the American Society for Horticultural Science. 121, 1002-1005 (1996).
  10. Rodrigo, J., Herrero, M. Effects of pre-blossom temperatures on flower development and fruit set in apricot. Scientia Horticulturae. 92, 125-135 (2002).
  11. Julian, C., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower bud differentiation and development in fruiting and non-fruiting shoots in relation to fruit set in apricot (Prunus armeniaca). Trees. 24, 833-841 (2010).
  12. Muñoz-Sanz, J. V., Zuriaga, E., López, I., Badenes, M. L., Romero, C. Self-(in)compatibility in apricot germplasm is controlled by two major loci, S and M. BMC Plant Biology. 17, 82 (2017).
  13. Burgos, L., Berenguer, T., Egea, J. Self- and Cross-compatibility among Apricot Cultivars. HortScience. 28, 148-150 (1993).
  14. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot “Moniqui”. Journal of Horticultural Science. 71, 801-805 (1996).
  15. Milatović, D., Nikolić, D., Krška, B. Testing of self-(in)compatibility in apricot cultivars from European breeding programmes. Horticultural Science. 40 (2), 65-71 (2013).
  16. Milatović, D., Nikolić, D., Fotirić-Aksić, M., Radović, A. Testing of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Acta Scientiarum Polonorum, Hortorum Cultus. 12 (6), 103-113 (2013).
  17. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of Self-Incompatibility Alleles by Specific PCR Analysis and S-RNase Sequencing in Apricot. Int J Mol Sci. 19, 3612 (2018).
  18. Romero, C., et al. Analysis of the S-locus structure in Prunus armeniaca L. Identification of S-haplotype specific S-RNase and F-box genes. Plant Molecular Biology. 56, 145-157 (2004).
  19. Halász, J., Pedryc, A., Hegedus, A. Origin and dissemination of the pollen-part mutated SC haplotype which confers self-compatibility in apricot (Prunus armeniaca). New Phytologist. 176, 792-803 (2007).
  20. Halász, J., Hegedus, A., Hermán, R., Stefanovits-Bányai, &. #. 2. 0. 1. ;., Pedryc, A. New self-incompatibility alleles in apricot (Prunus armeniaca L.) revealed by stylar ribonuclease assay and S-PCR analysis. Euphytica. 145, 57-66 (2005).
  21. Vilanova, S., Romero, C., Llacer, G., Badenes, M. L., Burgos, L. Identification of Self-(in)compatibility Alleles in Apricot by PCR and Sequence Analysis. Journal of the American Society for Horticultural Science. 130, 893-898 (2005).
  22. Feng, J., et al. Detection and transcript expression of S-RNase gene associated with self-incompatibility in apricot (Prunus armeniaca L.). Molecular Biology Reports. 33, 215-221 (2006).
  23. Zhang, L., et al. Identification of self-incompatibility (S-) genotypes of Chinese apricot cultivars. Euphytica. 160, 241-248 (2008).
  24. Wu, J., et al. Identification of S-haplotype-specific S-RNase and SFB alleles in native Chinese apricot (Prunus armeniaca L). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 84, 645-652 (2009).
  25. Szabó, Z., Nyéki, J. Blossoming, fructification and combination of apricot varieties. Acta Horticulturae. 293, 295-302 (1991).
  26. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K. U., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135, 410-417 (2010).
  27. Lachkar, A., et al. Identification of self-(in)compatibility S-alleles and new cross-incompatibility groups in Tunisian apricot (Prunus armeniaca L.) cultivars. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 88, 497-501 (2013).
  28. Pérez-Pastor, A., Ruiz-Sánchez, M. C., Domingo, R., Torrecillas, A. Growth and phenological stages of Búlida apricot trees in South-East. Agronomie. 24, 93-100 (2004).
  29. Williams, J. H., Friedman, W. E., Arnold, M. L. Developmental selection within the angiosperm style: using gamete DNA to visualize interspecific pollen competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 9201-9206 (1999).
  30. Julian, C., Herrero, M., Rodrigo, J. Anther meiosis time is related to winter cold temperatures in apricot (Prunus armeniaca L.). Environmental and Experimental Botany. 100, 20-25 (2014).
  31. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A., Rodrigo, J. Lack of Fruit Set Caused by Ovule Degeneration in Japanese Plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  32. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower Emasculation as the Cause for Lack of Fruit Set in Japanese Plum Crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  33. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  34. Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil Starch Reserves at Anthesis Correlate with Final Flower Fate in Avocado (Persea americana). PLOS ONE. 8 (10), 78467 (2013).
  35. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through Identification, Characterization and cDNA cloning for S-RNases in Sweet Cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124, 224-233 (1999).
  36. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science. 72, 147-154 (1997).
  37. Hormaza, J. I., Yamane, H., Rodrigo, J., Kole, C. Apricot. Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants, Volume 4 Fruits and Nuts. , 171-187 (2007).
  38. Benmoussa, H., Ghrab, M., Ben Mimoun, M., Luedeling, E. Chilling and heat requirements for local and foreign almond (Prunus dulcis Mill.) cultivars in a warm Mediterranean location based on 30 years of phenology records. Agricultural and Forest Meteorology. 239, 34-46 (2017).
  39. Rodrigo, J., Herrero, M., Hormaza, J. I. Pistil traits and flower fate in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Applied Biology. 154, 365-375 (2009).
  40. Williams, R. R., Williams, R. R., Wilson, D. Techniques used in fruit-set experiments. Towards Regulated Cropping. , 57-61 (1970).
  41. Sutherland, B. G., Robbins, T. P., Tobutt, K. R. Primers amplifying a range of Prunus S-alleles. Plant Breeding. 123, 582-584 (2004).
  42. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8, 4321-4325 (1980).
  43. Porebski, S., Bailey, L. G., Baum, B. R. Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol Components. Plant Molecular Biology Reporter. 15 (1), 8-15 (1997).
  44. Rogers, S. O., Bendich, A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology. 5 (2), 69-76 (1985).
  45. Hormaza, J. I. Molecular characterization and similarity relationships among apricot (Prunus armeniaca L.) genotypes using simple sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics. 104, 321-328 (2002).
  46. Sonneveld, T., Tobutt, K. R., Robbins, T. P. Allele-specific PCR detection of sweet cherry self-incompatibility (S) alleles S1 to S16 using consensus and allele-specific primers. Theoretical and Applied Genetics. 107, 1059-1070 (2003).
  47. Hegedus, A., Lénárt, J., Halász, J. Sexual incompatibility in Rosaceae fruit tree species: molecular interactions and evolutionary dynamics. Biologia Plantarum. 56 (2), 201-209 (2012).
  48. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  49. Company, R. S. i., Kodad, O., Martí, A. F. i., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: From deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  50. Boskovic, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  51. Cachi, A. M., Wünsch, A. S-genotyping of sweet cherry varieties from Spain and S-locus diversity in Europe. Euphytica. 197 (2), 229-236 (2014).
  52. Zuriaga, E., et al. An S-locus Independent Pollen Factor Confers Self-Compatibility in “Katy” Apricot. PLoS ONE. 8 (1), 53947 (2013).

Tags

Self-compatibilityInter-compatibilityIncompatibilityApricotHand-pollinationMicroscopyGenetic AnalysisPollination RequirementsCultivar IdentificationIncompatibility GroupsSelf-incompatibilityFruit Tree CropsCherryPlumBBCH ScaleEmasculationPollen GerminationMicroscopyFixative SolutionEthanolPollen Germination MediumSodium SulfiteAutoclaving

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses. J. Vis. Exp. (160), e60241, doi:10.3791/60241 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image