تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس الأصفر لوسيفر
Summary
الخلايا النجمية هي خلايا معقدة من الناحية الشكلية، وتتمثل في عملياتها المتعددة وأراضيها الكثيفة. لتحليل مورفولوجيا تفصيلا، ونحن نقدم بروتوكول موثوق بها لأداء الأيونتوبهوريس الأصفر داخل الخلايا في الأنسجة الثابتة طفيفة.
Abstract
الخلايا النجمية هي مكونات أساسية للدوائر العصبية. أنها البلاط الجهاز العصبي المركزي بأكمله (CNS) وتشارك في مجموعة متنوعة من الوظائف, التي تشمل إزالة الناقل العصبي, تنظيم أيون, تعديل متشابك, دعم التمثيل الغذائي للخلايا العصبية, وتنظيم تدفق الدم. الخلايا النجمية هي خلايا معقدة تحتوي على سوما، والعديد من الفروع الرئيسية، والعديد من العمليات الدقيقة التي تتصل بالعناصر الخلوية المتنوعة داخل neuropil. من أجل تقييم مورفولوجيا الخلايا النجمية ، من الضروري أن يكون لديك طريقة موثوقة واستنساخ لتصور بنيتها. نحن الإبلاغ عن بروتوكول موثوق به لأداء الأيونتوبهوريس داخل الخلايا من الخلايا النجمية باستخدام الفلورسنت لوسيفر الأصفر (LY) صبغ في أنسجة الدماغ ثابتة طفيفة من الفئران الكبار. هذه الطريقة لديها العديد من الميزات التي هي مفيدة لوصف مورفولوجيا الخلايا النجمية. وهو يسمح بإعادة بناء الخلايا النجمية الفردية ثلاثية الأبعاد، وهو أمر مفيد لإجراء تحليلات مورفولوجية على جوانب مختلفة من هيكلها. الكيمياء المناعية جنبا إلى جنب مع الأيونتوبهوريسيسي LY يمكن أيضا أن تستخدم لفهم تفاعل الخلايا النجمية مع مكونات مختلفة من الجهاز العصبي وتقييم التعبير عن البروتينات داخل الخلايا النجمية المسمى. ويمكن تنفيذ هذا البروتوكول في مجموعة متنوعة من نماذج الماوس من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي لفحص دقيق مورفولوجيا الخلايا النجمية مع الفحص المجهري الخفيف. يوفر داء الأيونتوبهوريس لي نهجا تجريبيا لتقييم بنية الخلايا النجمية، وخاصة في سياق الإصابة أو المرض حيث يقترح أن تخضع هذه الخلايا لتغيرات مورفولوجية كبيرة.
Introduction
الخلايا النجمية هي الخلايا الغليفية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). أنها تلعب أدوارا في التوازن أيون, تنظيم تدفق الدم, تشكيل متشابك، فضلا عن القضاء, والناقل العصبي التناول1. وينعكس مجموعة واسعة من وظائف الخلايا النجمية في بنيتها المورفولوجية المعقدة2،3. تحتوي الخلايا النجمية على العديد من الفروع الأولية والثانوية التي تنقسم إلى الآلاف من الفروع الدقيقة والمنشورات التي تتفاعل مباشرة مع نقاط الاشتباك العصبي، dendrites، المحاور، الأوعية الدموية، وغيرها من الخلايا الدبقية. يختلف مورفولوجيا الخلايا النجمية عبر مناطق الدماغ المختلفة، والتي قد تلمح إلى قدرتها على أداء وظائفها بشكل تفاضلي في الدوائر العصبية4. وعلاوة على ذلك، من المعروف أن الخلايا النجمية لتغيير مورفولوجيا أثناء التنمية، وخلال الظروف الفسيولوجية، وفي حالات المرض متعددة3،5،6.
هناك حاجة إلى طريقة متسقة، قابلة للاستنساخ لحل بدقة تعقيد مورفولوجيا الخلايا النجمية. تقليديا، وقد استخدمت الكيمياء المناعية لتصور الخلايا النجمية مع استخدام علامات البروتين الغنية بالخلايا النجمية أو astrocyte محددة. ومع ذلك، تكشف هذه الطرق عن نمط التعبير البروتين بدلاً من بنية الخلايا النجمية. علامات شائعة الاستخدام، مثل البروتين الحمضي الفيبريلي الغليفي (GFAP) وS100 بروتين الكالسيوم ملزمة β (S100β)، لا تعبر في حجم الخلية بأكمله، وبالتالي لا تحل مورفولوجيا كاملة7. يمكن للنهج الوراثية للتعبير عن البروتينات الفلورية في كل مكان في الخلايا النجمية (الحقن الفيروسية أو خطوط مراسل الماوس المعدلة وراثيا) تحديد الفروع الدقيقة والأراضي عموما. ومع ذلك، فمن الصعب التمييز بين الخلايا النجمية الفردية، والتحليلات قد تكون متحيزة من قبل السكان astrocyte المستهدفة من قبل المروج محددة8. وقد استخدم المقطع التسلسلي مجهري الإلكترون للكشف عن صورة مفصلة للتفاعلات من عمليات الخلايا النجمية مع نقاط الاشتباك العصبي. بسبب الآلاف من عمليات الخلايا النجمية الاتصال نقاط الاشتباك العصبي، فإنه من غير الممكن حاليا لإعادة بناء خلية كاملة مع هذه التقنية9، على الرغم من أن هذا من المتوقع أن تتغير مع استخدام نهج التعلم الآلي لتحليل البيانات.
في هذا التقرير، نركز على إجراء لتوصيف الخلايا النجمية للماوس باستخدام أيونتوبهوريس داخل الخلايا مع صبغة لوسيفر الصفراء (LY)، وذلك باستخدام أشعة الطبقة CA1 كمثال. ويستند الأسلوب على العمل السابق الرائد من قبل اريك Bushong ومارك Ellisman10،11. يتم تحديد الخلايا النجمية من شرائح الدماغ ثابتة بخفة من خلال شكل هاسيما مميزة ومليئة LY. ثم يتم تصوير الخلايا مع الفحص المجهري البؤري. نبين كيف يمكن استخدام الأيونوفوريسيس LY لإعادة بناء الخلايا النجمية الفردية وإجراء تحليلات مورفولوجية مفصلة لعملياتها وأراضيها. أيضا، يمكن تطبيق هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية لتحديد العلاقات المكانية والتفاعلات بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية، والخلايا الدبقية الأخرى، والأوعية الدموية في الدماغ. ونحن نعتبر LY iontophoresis لتكون أداة مناسبة جدا لتحليل مورفولوجيا في مناطق الدماغ المختلفة ونماذج الماوس من الظروف الصحية أو المرض7،12،13.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة المبينة في هذه الورقة تصف طريقة لتصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس داخل الخلايا من صبغ LY في شرائح الدماغ ثابتة قليلا. هناك العديد من العوامل الحاسمة التي تم تسليط الضوء عليها في هذا البروتوكول التي تسهم في نجاح LY الأيونتوبهوريسوإعادحي المورفولوجية للخلايا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر أصحاب البلاغ السيدة سوتو والدكتور يو والدكتور أوكتو على التوجيه وكذلك على التعليقات على النص. هذا العمل معتمد من قبل NS060677.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
Referências
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neurociência. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
