Un protocolo basado en FACS para aislar el ARN de las células secundarias de Drosophila Male Accessory Glands

Los órganos se componen de múltiples tipos de células, cada una con funciones discretas y a veces expresando conjuntos muy diferentes de genes. Para obtener una comprensión precisa de cómo funciona un órgano, a menudo es fundamental estudiar cada tipo de célula distinta que compone este órgano. Uno de los métodos principales utilizados para explorar la posible función es el análisis del transcriptoma. Este potente método proporciona una instantánea de la expresión génica en una célula, para revelar los procesos y vías activas. Sin embargo, este tipo de análisis es a menudo difícil para las poblaciones de células raras que deben ser purificadas a partir de células vecinas mucho más abundantes. Por ejemplo, la glándula accesoria masculina Drosophila es un órgano compuesto principalmente de dos tipos de células secretoras. Como el más raro de los dos tipos de células comprende sólo el 4% de las células de esta glándula, el uso de un análisis de transcriptoma específico de tipo celular no se había utilizado para ayudar a determinar la función de estas células.

Las glándulas accesorias (AG) son órganos del tracto reproductivo masculino en insectos. Son responsables de la producción de la mayoría de las proteínas del líquido seminal (proteínas de líquido seminal (SFP) y proteínas de la glándula accesoria (ACL)). Algunos de estos SFP son conocidos por inducir las respuestas fisiológicas y conductuales en las hembras apareadas, comúnmente llamada la respuesta post-acoplamiento (PMR). Algunos de los PMR incluyen: un aumento de la ovulación y la tasa de puesta de óvulos, el almacenamiento y liberación de espermatozoides, un cambio en la dieta femenina, y una disminución en la receptividad femenina a los varones de cortejo secundario^1,2. Dado que los insectos afectan a muchas de las principales cuestiones sociales, desde la salud humana (como vectores de enfermedades mortales) hasta la agricultura (los insectos pueden ser plagas, pero son críticos para la polinización y la calidad del suelo), la comprensión de la reproducción de insectos es un área importante de investigación. El estudio de los AG y los ACP se ha avanzado significativamente con el organismo modelo Drosophila melanogaster. Estos estudios han puesto de relieve el papel de los AG y algunas de las proteínas individuales que producen en la creación del PMR, impactando el trabajo en otras especies como el vector de la enfermedad Aedes aegypti^3,4,y otros insectos^{1 ,5}. Además, como los aGs secretan los componentes del fluido seminal^1,6 son a menudo considerados como el análogo funcional de la glándula prostática de mamíferos y la vesícula seminal. Esta similitud de función combinada con similitudes moleculares entre los dos tipos de tejido, han hecho de los AG un modelo para la glándula prostática en moscas^7.

Dentro del macho Drosophila, hay dos lóbulos de glándulas accesorias. Cada lóbulo puede ser visto como una estructura similar a un saco compuesto por una monocapa de células secretoras que rodean un lumen central, y envuelto por músculos lisos. Como se mencionó anteriormente, hay dos tipos de células secretoras morfológica, de desarrollo y funcionalmente distintas que componen esta glándula: las células principales en forma poligonal (que componen el 96% de las células), y las células secundarias redondas (SC) más grandes (que componen el 4% restante de las células, o alrededor de 40 células por lóbulo). Se ha demostrado que ambos tipos de celda producen conjuntos distintos de ACL para inducir y mantener el PMR. La mayoría de los datos obtenidos hasta la fecha destacan el papel de una sola proteína en la activación de la mayoría de los comportamientos característicos de la PMR. Esta proteína, el péptido sexual, es un pequeño péptido de 36 aminoácidos que es secretado por las células principales^8,9,10. Aunque el péptido sexual parece desempeñar un papel importante en el PMR, otros ACP, producidos por las células principales y secundarias, también han demostrado afectar a varios aspectos de la PMR^{11,12,13,14 ,15,16,17}. Por ejemplo, sobre la base de nuestros conocimientos actuales, los SC, a través de las proteínas que producen, parecen ser necesarios para la perpetuación de la señalización SP después del primer día^18.

Dada la rareza de los SC (sólo 80 células por macho), todo nuestro conocimiento sobre estas células y las proteínas que producen proviene de la genética y los enfoques candidatos. Hasta ahora, sólo se ha demostrado que una lista relativamente pequeña de genes es específica de SC. Esta lista incluye la proteína homeodominio Proventriculus defectuoso (Dve)¹⁹, el lncRNA MSA²⁰, Rab6, 7, 11 y 19²¹, CG1656 y CG17575^{11, 15,21} y el factor de transcripción homeobox Abdominal-B (Abd-B)¹⁸. Anteriormente, hemos demostrado que un mutante deficiente tanto para la expresión de Abd-B como para el LncRNA MSA en células secundarias(iab-6^cocuD1 mutante) acorta la longitud de la PMR de 10 días a solo un día^{12 , 18 , 20}. Este fenotipo parece ser causado por el almacenamiento inadecuado de SP en el tracto reproductivo femenino^12,18,20. A nivel celular, las células secundarias de este mutante muestran morfología anormal, perdiendo sus características estructuras similares a la vacuola^18,20,21. Usando esta línea mutante, previamente intentamos identificar los genes involucrados en la función SC comparando los perfiles transcripcionales de los aGenteros de tipo salvaje o glándulas accesorias mutantes^12. Además, otros laboratorios mostraron que el número de SC, la morfología y el contenido vacuolar dependen de la dieta masculina, el estado de apareamiento y la edad^21,25,26.

Aunque se lograron progresos positivos utilizando estos enfoques, un transcriptoma completo de SC dista mucho de lograrse. La rareza de estas células en este órgano hizo difícil progresar aún más incluso desde células de tipo salvaje. Para probar la expresión génica, los cambios en estas células después de estímulos ambientales particulares serían aún más difíciles. Por lo tanto, se necesitaba un método para aislar y purificar el ARN SC que fuera lo suficientemente rápido y simple como para funcionar bajo diferentes orígenes genéticos y condiciones ambientales.

Tanto los genes Abd-B como MSA requieren un potenciador específico de 1,1 kb del Complejo Drosophila Bithorax (llamado potenciador D1) para su expresión en SCs^18,20. Este potenciador se ha utilizado anteriormente para crear un controlador GAL4 que, cuando se asocia con un UAS-GFP,es capaz de impulsar la expresión GFP fuerte específicamente en SCs. Por lo tanto, usamos esta línea como base para un protocolo FACS para aislar estas células del tipo salvaje y del iab-6^{cocuD1 AG).} Como los SC mutantes iab-6^cocuD1 muestran una morfología celular diferente, mostramos que este protocolo se puede utilizar para aislar las células para la determinación de su transcriptoma de este tipo de célula rara en condiciones muy diferentes.