Luminescence Lifetime Imaging of O<sub>2</sub> with a Frequency-Domain-Based Camera System

Maria Mo&#223;hammer; Vincent  V. Scholz; Gerhard Holst; Michael K&#252;hl; Klaus Koren

doi:10.3791/60191

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Química

Luminescence Lifetime Imaging of O₂ avec un système de caméra basé sur le domaine de fréquence

Published: December 16, 2019

doi:

10.3791/60191

Maria Moßhammer*¹, Vincent V. Scholz*², Gerhard Holst³, Michael Kühl^1,4, Klaus Koren⁵

¹Marine Biological Section, Department of Biology,University of Copenhagen, ²Center for Electromicrobiology,Aarhus University, ³PCO AG, ⁴Climate Change Cluster,University of Technology Sydney, ⁵Aarhus University Centre for Water Technology, Section for Microbiology, Department of Bioscience,Aarhus University

Summary

Nous décrivons l’utilisation d’une nouvelle caméra à vie de luminescence de domaine de fréquence pour cartographier les distributions 2D O₂ avec des feuilles de capteur optique. Le système de caméra et les procédures d’analyse d’image sont décrits avec la préparation, l’étalonnage et l’application des foils de capteur pour visualiser le microenvironnement O₂ dans la rhizosphère des plantes aquatiques.

Abstract

Nous décrivons une méthode pour imager l’oxygène dissous (O₂), en 2D à haute résolution spatiale (lt; 50-100 ‘m) et temporelle (lt; 10 s) résolution. La méthode utilise des feuilles de capteur luminescentes sensibles O₂ (optodes planaires) en combinaison avec un système de caméra spécialisé pour l’imagerie de la durée de vie de la luminescence dans le domaine de la fréquence. Les optodes planaires sont préparés en dissolvant le colorant indicateur O_2-sensibledans un polymère et en étalant le mélange sur un support solide dans une épaisseur définie par l’intermédiaire du revêtement de couteau. Après l’évaporation du solvant, l’optode planaire est placé en contact étroit avec l’échantillon d’intérêt – ici démontré avec les racines de la plante aquatique Littorella uniflora. Le changement O₂ dépendant de la concentration dans la durée de vie de luminescence du colorant indicateur dans l’optode planaire est représenté par l’arrière du papier d’aluminium transparent et du mur d’aquarium à l’aide d’une caméra spéciale. Cette caméra mesure la durée de vie de la luminescence par un décalage dans l’angle de phase entre un signal d’excitation modulée et un signal d’émission. Cette méthode est supérieure aux méthodes d’imagerie par intensité de luminescence, car le signal est indépendant de la concentration de colorant ou de l’intensité de la source d’excitation, et repose uniquement sur le temps de décomposition de la luminescence, qui est un paramètre intrinsèquement référencé. Par conséquent, un colorant de référence supplémentaire ou d’autres moyens de référencement ne sont pas nécessaires. Nous démontrons l’utilisation du système pour l’imagerie macroscopique O₂ des rhizosphères végétales, mais le système de caméra peut également facilement être couplé à un microscope.

Introduction

La distribution et la dynamique des gaz et des ions dissous dans les sédiments et les sols fournissent des informations clés sur les processus biogéochimiques tels que la respiration microbienne¹^,², ou la perte d’oxygène radiale des racines des plantes³^,⁴^,⁵, et le microenvironnement chimique des microbes⁶^,⁷, rhizosphères végétales⁵^,⁸^,⁹ et les terriers d’animaux¹⁰^, ¹¹^,¹². L’activité biologique et chimique dans de tels environnements limités par la diffusion peut créer des gradients abrupts de substrats chimiques ou de produits de processus biogéochimiques. En particulier, la disponibilité O₂ a un impact énorme sur les processus biogéochimiques et donc la biologie et l’écologie d’un système¹³. Par conséquent, l’analyse des concentrations d’O₂ à haute résolution spatiale et temporelle est d’une importance primordiale dans les sciences aquatiques et terrestres. Tout d’abord, des microcapteurs électrochimiques et optiques¹⁴^,¹⁵ ont été développés pour mesurer cet analyte important. Plus tard, l’imagerie 2 dimensionnelle (2D) de O₂ avec optodes planaires a été introduite¹²^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹, ce qui a permis la visualisation et la quantification de la distribution hétérogène O₂ dans les sols et les sédiments.

Planaires O₂ optodes se composent d’un O₂-sensible colorant indicateur²⁰, qui est dissous dans un polymère approprié²¹. Le colorant indicateur est excité à des longueurs d’onde optiques spécifiques et émet de la lumière rouge décalée sur la relaxation sous forme de luminescence. En présence de O₂, le colorant indicateur excité peut transférer son énergie à la molécule O₂ lors de la collision, qui est appelé étanchéité à base de collision²². Par conséquent, l’intensité de luminescence aussi bien que la durée de vie de luminescence sont réduites avec l’augmentation de la concentration d’O₂ ^23. Dans un cas idéal, le changement d’intensité et de durée de vie suit l’équation Stern-Volmer (équation 1) en utilisant soit l’intensité de la luminescence ou la durée de vie en l’absence (I₀;₀) ou la présence (I, ‘ ) de O₂ à une concentration donnée [Q]. La constante Stern-Volmer (K_sv) est une mesure de la sensibilité de l’optode vers O₂; K_SV dépend de variables environnementales telles que la température et la pression.

(1)

L’enregistrement de tels changements de luminescence sur une feuille de capteur planaire avec un système de caméra peut être utilisé pour visualiser les changements correspondants dans la distribution O_2. Initialement, l’imagerie O₂ basée sur l’intensité de la luminescence simple a été utilisée¹⁸. Cependant, une telle méthodologie est très sensible aux interférences externes, qui compromettent la fiabilité des résultats en raison de l’éclairage hétérogène, des fluctuations de la source d’excitation ou de la caméra, ainsi que la distribution inégale du colorant indicateur dans l’optode planaire.

Certaines de ces limitations peuvent être atténuées en utilisant des optodes planaires pour l’imagerie ratiométrique¹⁷^,²⁴, où le colorant indicateur O_2-sensibleest co-immobilisé dans la couche de polymère de l’optode planaire avec un colorant de référence insensible émettant dans une gamme spectrale différente de l’indicateur O_2. Basé sur les images d’émission acquises dans deux fenêtres spectrales, le signal d’émission O_2-sensibleest divisé par le signal de référence, générant une image de ratio qui est moins sujette aux interférences mentionnées ci-dessus⁵^,¹⁷. La méthode nécessite l’utilisation d’un second colorant, qui peut idéalement être excité par la même source d’excitation, mais émet à une longueur d’onde différente (sans chevauchement spectral significatif), dans une autre fenêtre spectrale de la caméra (par exemple, dans un autre canal couleur d’une caméra RGB).

Alternativement, l’imagerie O₂ peut être basée sur la quantification du changement O_2-dépendantdans la durée de vie de luminescence du colorant indicateur, qui n’est pas affecté par l’éclairage inégal ou les hétérogénéités dans la concentration de l’indicateur²⁵. Les premiers systèmes d’imagerie O₂ à durée de vie de luminescence ont été basés sur des mesures de domaine temporel avec un système de caméra couplé (CCD) à périphérique couplé à la porte (CCD)²⁶, où une source d’excitation pulsée est utilisée et où des images de luminescence sont prises sur des intervalles de temps définis dans l’excitation ou l’émission de l’indicateur⁸^,²³^,²⁷. De telles images, la durée de vie de luminescence peut être déterminée et corrélée à la concentration correspondante d’O₂ dans un étalonnage. Par la suite, les images de la durée de vie de luminescence pour un échantillon donné pressé contre l’optode planaire peuvent être converties en images de la distribution 2D correspondante de la concentration o_2. Ce système a été utilisé dans de nombreuses applications à la fois en laboratoire et in situ¹⁶^,²⁸, mais la caméra CCD essentielle porte-capable n’est plus disponible dans le commerce.

Récemment, un système de caméra à vie luminescence différente a été libéré, qui acquiert des images dans le domaine de fréquence⁸. Le système repose sur une source de lumière continuellement modulée pour l’excitation. Il peut s’agir d’une onde sinusoïdale ou carrée au lieu d’une excitation pulsée, qui est utilisée pour l’acquisition d’images dans le domaine temporel. Cette modulation se traduit par une émission de luminescence modulée du colorant indicateur O_2, qui est décalé e par un angle, qui dépend de la durée de vie de la luminescence du colorant indicateur (voir l’équation 2).

(2)

Le changement entre l’excitation et l’amplitude des émissions (c’est-à– à l’indique, l’indice ou la profondeur dit de modulation (amplitude divisée par la partie de luminescence constante)) dépend également de la durée de vie de la luminescence. Ainsi, en définissant une fréquence de modulation connue le capteur d’image spécial CMOS dans la caméra est capable de mesurer la durée de vie de la luminescence dans la gamme ns à ‘s comme décrit en détail ailleurs ⁸^,²⁹^,³⁰. Un guide général sur le principe d’exploitation peut être trouvé (en utilisant le lien suivant https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).

Dans le protocole suivant, nous démontrons l’utilisation du nouveau système de caméra pour l’imagerie de la distribution de la concentration O₂ autour des racines de la plante d’eau douce aquatique Littorella uniflora en 2D⁹^,³¹. Nous tenons à souligner que cette méthode n’est nullement limitée à cette application. Optodes sensibles à l’oxygène ou particules de capteurs²⁷ en combinaison avec diverses méthodes d’imagerie ont été utilisés dans la recherche médicale³², dans la bioimpression³³, pour les peintures sensibles à la pression³⁴^,³⁵, ou pour étudier les systèmes photosynthétiques²^,³⁶^,³⁷, pour n’en nommer que quelques autres domaines d’application.

Protocol

1. Fabrication de planaire O2 optode Dissoudre 1,5 mg du colorant perfle O2 (II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrine (PtTFPP) et 100 mg de polystyrène (PS) dans 1 g de chloroforme pour obtenir le soi-disant «cocktail capteur».REMARQUE : Le cocktail peut être conservé dans une fiole de verre fermée et étanche au gaz pendant quelques heures au réfrigérateur et dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il soit utilisé davantage. Fixer une feuille de polyéthylène téréphtalate (PET) propre et sans poussière (taille dépendante de l’application) sur une plaque de verre nettoyée à l’aide d’une eau ou d’un éthanol (70 %) film (Figure 1A). Placez le dispositif de revêtement de couteau nettoyé (120 m) sur le papier d’aluminium et appliquez une ligne du cocktail du capteur devant l’appareil à l’aide d’une pipette en verre (figure 1B). Ensuite, faites glisser le dispositif de revêtement de couteau lentement et uniformément sur le papier d’aluminium PET pour répartir le cocktail uniformément.REMARQUE : Tous les matériaux et outils doivent être nettoyés à fond et la fabrication doit être effectuée dans un environnement exempt de poussière, comme une hotte de fumée, un banc d’écoulement ou sous un dispositif d’aspiration de point. Pour éviter les hétérogénéités dans le papier d’aluminium du capteur final, les étapes suivant l’application du cocktail du capteur sur le papier d’aluminium doivent être faites rapidement, car le chloroforme s’évapore rapidement. Sécher le planaire fini O2-optode sensible dans l’air ambiant pendant 1 h, puis la nuit dans une armoire chauffante à 50-60 oC, résultant à une épaisseur de couche finale après évaporation solvante de 12 m. Stocker les optodes produites dans l’obscurité (par exemple, dans une enveloppe de papier) jusqu’à une utilisation ultérieure (Figure 1C).REMARQUE : Les optodes planaires O2 peuvent être entreposées à sec et dans l’obscurité pendant plusieurs mois ou plusieurs années avant leur utilisation. Une épaisseur de couche finale allant de 1 à 20 m s’est avérée être un bon résultat, avec un signal de luminescence suffisant et des temps de réponse adéquats. 2. Chambre Rhizo-sandwich Nettoyer deux plaques de verre (24,5 x 14 cm2, épaisseur : 4 mm) avec 96 % d’éthanol. Utilisez un adhésif instantané à base d’acrylique léger (voir Tableau des matériaux)pour coller les lames de microscope (76 x 26 mm2, épaisseur : 1 mm) le long des bords de la première plaque de verre (c.-à-d. le côté de la chambre arrière), tout en laissant un long bord ouvert. Utilisez un coupe-verre pour raccourcir les lames de microscope au besoin.CAUTION: Couper le verre peut causer des bords tranchants et doit être manipulé avec soin.REMARQUE : Les diapositives de microscope fonctionnent comme des espaceurs entre l’avant et le dos, et selon l’épaisseur des racines et la taille de la plante, plusieurs couches de glissières de microscope peuvent être collées les unes sur les autres. Couper l’optode planaire dans la forme et la taille requises pour s’insérer dans l’espace entre les lames de microscope collées. Placez-le à l’intérieur de la plaque de verre avant avec le côté enduit vers le haut, pour permettre le contact avec l’échantillon d’intérêt lorsqu’il est pressé contre elle. Tapez un bord du papier d’aluminium d’optode à la plaque de verre et ajoutez quelques gouttes d’eau du robinet entre la plaque de verre et le papier d’aluminium optode (Figure 2A). Baisser lentement le papier d’aluminium sur ces gouttelettes d’eau lui permettant de se redresser sur la surface de verre. Retirez soigneusement les bulles d’air emprisonnées entre l’optode planaire et la plaque de verre à l’aide d’un tissu mou, tout en évitant de rayer le revêtement du capteur. Essuyez la plaque de verre à sec et ruban adhésif les bords restants du papier d’aluminium optode à la plaque de verre (Figure 2B).REMARQUE : Il faut choisir une bande avec une adhérence appropriée sous l’eau. Tamiser les sédiments à l’aide d’un treillis de 0,5 mm. Placez une cuillère de sédimenthumide sur la première plaque de verre (figure 2C).REMARQUE : La taille du maillage ne doit pas être supérieure à la moitié de l’épaisseur de l’espaceur. Distribuez les sédiments uniformément et ajustez-les à la même épaisseur que les espaceurs de glissement au microscope à l’aide d’une plaque de verre plate. Nettoyez soigneusement la surface supérieure des lames de microscope pour s’assurer que la deuxième plaque de verre scelle correctement la chambre. Appliquer de la graisse de silicium sur la surface de la glissière du microscope. Couvrir les sédiments d’un mince film d’eau, tout en évitant soigneusement la formation de bulles d’air. Lavez soigneusement une seule pousse de Littorella uniflora et placez-la sur les sédiments, les feuilles de la plante sortant du côté ouvert supérieur(figure 2D). Placez la deuxième plaque de verre, avec l’optode attaché à elle, sur les sédiments et appliquez une pression douce pour mettre l’optode en contact étroit avec les racines de la plante et les sédiments environnants.REMARQUE : Les bulles d’air emprisonnées dans les sédiments peuvent être enlevées en inclinant les plaques de verre tout en les rassemblant. Attachez les plaques de verre ensemble à l’aide de pinces (Figure 2E). Séchez les bords extérieurs avec du papier de soie. Gardez les feuilles hydratées tout au long de l’assemblage du rhizo-sandwich (p. ex., en y ajoutant fréquemment quelques gouttes d’eau). Resserrer la chambre rhizo-sandwich à l’aide de ruban électrique en vinyle. Scellez les bords avec de l’argile de modélisation et en plus les ruban adhésif avec du ruban électrique en vinyle (Figure 2F).REMARQUE : S’il y a beaucoup de bulles d’air dans les sédiments, ou des grains de sédiments entre les lames de microscope d’espaceur et la deuxième plaque de verre, la chambre devrait être remontée pendant que l’eau de pore peut s’écouler (étapes répétées 2.4 – 2.8). Utilisez un plastique opaque pour couvrir le rhizo-sandwich, mais laissez une éliture dans le papier d’aluminium pour que les feuilles de la plante sortent. Couper une fenêtre dans la feuille de plastique, de sorte qu’il peut être ouvert pour les expériences en se déroulant. Fermez la fenêtre pendant les périodes d’acclimatation à l’aide d’élastiques (figure 2G) pour protéger l’optode contre le blanchiment photo pendant l’incubation de la plante.REMARQUE : Comme la croissance des algues pourrait potentiellement interférer avec les concentrations d’O2 mesurées, nous recommandons d’essayer de la minimiser, en utilisant de l’eau filtrée, de l’équipement expérimental pré-nettoyé et en enlevant les algues lors de la formation. 3. Incubation de chambre de Rhizo-sandwich Placer la chambre rhizo-sandwich dans un réservoir d’eau (32 x 7 x 28 cm3) dans une position légèrement inclinée pour encourager la croissance des racines contre l’optode planaire. Remplissez le réservoir d’eau avec assez d’eau pour immerger complètement les feuilles de la plante. Établir un cycle sombre de 14 h pour l’acclimatation de la plante à l’aide d’une lampe à commande temporelle. Placer une pierre d’air ou une pompe à eau dans le réservoir pour assurer l’aération et le mélange de l’eau (Figure 2H). 4. Imagerie Configuration d’imagerie Retirer le papier d’aluminium qui recouvre l’optode planaire dans la chambre rhizo-sandwich. Placez la chambre avec le mur de verre avec l’optode verticalement contre le mur de l’aquarium. Utilisez un espaceur pour appuyer sur la chambre rhizo-sandwich contre le mur de l’aquarium.REMARQUE: L’épaisseur globale de la paroi de l’aquarium ainsi que le mur de chambre rhizo-sandwich ne devrait pas devenir trop épais, cependant, les épaisseurs de verre pour les murs de aquarium pour l’imagerie de luminescence sont recommandés avec ‘gt; 1 cm, afin de réduire le cross-talk spatial en augmentant l’atténuation de la lumière dispersée. Il est important d’utiliser le même matériau pour les deux parois de verre (même indice réfractaire), afin de minimiser la diffusion de la lumière à l’interface du matériau; car cela conduirait à une image floue ainsi12. Placez la caméra à vie à base de luminescence à base de fréquence-domaine équipée d’un objectif (voir Tableau des matériaux) devant l’aquarium et la zone d’intérêt (racines de la plante aquatique Littorella uniflora, qui sont en contact direct avec l’optode planaire) (Figure 3).REMARQUE : La caméra peut être placée sur un support de laboratoire pour permettre un réglage de hauteur facile de la caméra. La position du support de laboratoire doit être marquée et maintenue fixe. En outre, la caméra peut être enregistrée sur le support de laboratoire pour éviter le mouvement accidentel de la caméra pendant l’expérience. Visunvis un filtre d’émission approprié pour l’imagerie PtTFPP comme colorant indicateur (voir Tableau des matériaux) sur l’objectif de la caméra, pour supprimer les inférences de la source d’excitation.REMARQUE : Les filtres vissés sont idéaux, mais les filtres carrés peuvent également être utilisés soit avec un adaptateur approprié, soit en les tapant soigneusement à l’objectif. Connectez une source d’excitation LED (voir Tableau des matériaux) à la modulation et à la sortie de la porte sombre de la caméra.REMARQUE : Le premier émet le signal de modulation pour la source lumineuse, tandis que le second éteint la lumière lors de la lecture de l’image du capteur d’image. Connectez la source d’excitation LED et la caméra à un ordinateur. La lumière de fond doit être réduite au minimum pendant la lecture d’image, en assombrissant la pièce entière ou en mettant un tissu noir dense sur l’ensemble de la configuration. Dans ce dernier cas, il est important d’assurer une ventilation suffisante pour éviter le chauffage de la caméra. Fixez le guide lumineux dans la source d’excitation LED et placez-le pour éclairer uniformément le papier d’optode planaire couvrant la zone d’intérêt.REMARQUE: Dans la source d’excitation LED utilisée, il est possible de basculer entre 3 LED différentes (460 nm, 528 nm, 625 nm), dont l’intensité peut être ajustée via le logiciel de contrôle. Paramètres et fonctionnement de la caméraREMARQUE : Pour les expériences décrites, nous avons utilisé une caméra à vie basée sur le domaine de fréquence en combinaison avec un module dédié à l’imagerie à vie dans un logiciel disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux). Sélectionnez l’appareil photo dans le logiciel choisi avant d’être utilisé.REMARQUE : Les pilotes de logiciels et d’appareils photo doivent être installés avant l’imagerie conformément aux directives des fabricants. Ouvrez le logiciel de contrôle LED (à nouveau installé avant de commencer l’expérience) et choisissez la LED appropriée (ici: 528 nm) en cochant le standby. Définir l’intensité LED au besoin (ici à 30%). Assurez-vous que la LED est déclenchée par le TTL externe; cela se fait en cochant analogique et la synchronisation pour la LED.REMARQUE : L’intensité LED doit être ajustée individuellement, car une puissance laser trop élevée peut conduire à un blanchiment photo accéléré de l’indicateur ou du colorant de référence. Concentrez la caméra et ajustez manuellement l’ouverture de l’objectif (dans la présente étude, utilisez f 2,8).REMARQUE: Il est important de concentrer la caméra sur l’optode planaire et non sur le verre de l’aquarium; cela peut être assuré en prenant une image avec une règle pour l’échelle, et en se concentrant sur l’ombre de la règle sur l’optode, plutôt que sur la règle réelle. Définissez les paramètres suivants dans le panneau de contrôle de la caméra du logiciel : source de modulation interne ; onde sinissime pour la forme d’onde de sortie; l’échantillonnage de phase supplémentaire (Oui); 8 échantillons de phase, ordre de phase en face, Appuyez sur appuyez sur la lecture A et B; Fréquence de modulation de 5 kHz.REMARQUE : Ces paramètres affectent la qualité de l’image et peuvent être modifiés si nécessaire. Le fabricant de l’appareil photo fournit des lignes directrices sur les paramètres individuels (Le fabricant de l’appareil publie des lignes directrices et des mises à jour chaque fois que le logiciel est mis à jour). Prenez une image de référence avant les expériences.REMARQUE : Cela peut être fait soit en imagerie d’une norme d’étalonnage (un colorant luminescent avec une durée de vie connue (ns ou s)), ou en utilisant la lumière réfléchie de la LED. Dans ce dernier cas, le filtre à long passage d’émission doit être retiré de l’objectif et la durée de vie connue peut être fixée à 1 ns. Ajuster le temps d’exposition dans la section d’étalonnage du logiciel d’imagerie dédié jusqu’à ce que la lecture des statistiques de retour sur investissement (en bas de ce panneau) pour l’image normalisée d’intensité de luminescence soit de l’ordre de 0,68 – 0,72.REMARQUE : Maintenant, la durée de vie de référence (p. ex., 1 ns) est donnée en entrée au logiciel. Référence De capture de presse pour commencer l’acquisition d’une série de mesure de référence.REMARQUE : Une fois terminées, les données de référence sont stockées et des mesures ponctuelles ou temporelles peuvent être effectuées sur des échantillons. Calibration de l’optode O2 Placez un morceau d’optode planaire O2-sensibledans un (petit) aquarium en verre. Fixer l’optode planaire sur la paroi de verre de la chambre d’étalonnage telle que décrite précédemment (voir la section 2.3). Placez l’aquarium d’étalonnage devant la caméra. Assurer l’éclairage même par la LED, ainsi que que l’optode remplit l’ensemble du champ de vision.REMARQUE : L’optode planaire doit être issu du même morceau de papier d’aluminium ou fabriqué à partir du même cocktail de capteur que le papier d’aluminium utilisé dans l’expérience proprement dite. Remplissez l’aquarium avec le même milieu liquide que celui utilisé dans les expériences.REMARQUE : L’utilisation de différents supports pour les étalonnages et les expériences peut influencer la mesure (p. ex., en modifiant la réponse du capteur et/ou la solubilité O2). Ainsi, l’étalonnage doit être fait dans le même milieu, et à la même température que l’expérience réelle. Les fluctuations de température affecteront le signal de luminescence et doivent être évitées. Toutefois, si la température ne peut pas être maintenue stable, la compensation de la température doit être effectuée en étalonnant l’optode sensible À l’O2(plusieurs points) à différentes températures (pertinentes) et en recalculant les valeurs ultérieures. Ajuster la concentration d’O2 dans l’aquarium d’étalonnage en rinçant l’eau avec un mélange de gaz air/N2 de concentration connue d’O2, à l’aide d’un dispositif de mélange de gaz. Assurez-vous que l’eau est bien réquidiée avec le mélange de gaz utilisé en aérant pendant un temps suffisant (dépend du débit et de la taille de l’aquarium).REMARQUE : Nous recommandons de surveiller le niveau O2 dans l’aquarium d’étalonnage à l’aide d’un capteur O2 externe calibré avec compensation de température (p. ex., à l’aide d’un capteur de fibre optique ou d’o2 électrochimique). Prenez une série d’images à différentes concentrations O2 dans la chambre d’étalonnage.REMARQUE : Au moins cinq concentrations différentes d’O2 doivent être mesurées afin de permettre une courbe appropriée adaptée aux données d’étalonnage acquises. Il est important de mesurer à 0 hPa (conditions anoxiques), puis de distribuer les autres valeurs sur la plage dynamique de votre colorant indicateur spécifique. Ici, nous avons utilisé PtTFPP comme colorant indicateur O2-sensibleimmobilisé dans une matrice de polystyrène. Les images ont été prises à 0, 48, 102, 156, et 207 hPa; 207 hPa correspond à une saturation de l’air à 100% à la salinité et à la pression données. Imagerie de l’échantillon Placez l’échantillon devant la caméra et assurez-vous d’un éclairage uniforme. Éteignez la lumière fournissant de l’irradiation à la plante (et à toutes les autres sources de lumière) juste avant d’acquérir l’image de vie de luminescence de la plante. Ajuster le temps d’acquisition en fonction de l’image d’intensité, en veillant à ce que le signal ne soit ni sursaturé ni trop faible pour un bon rapport signal-bruit (S/N) dans la détermination de la durée de vie. Exposez la plante à des conditions de lumière variables (p. ex., lumière/obscurité) et acquérez un ensemble d’images. Allumez la lumière dans la pièce pour acquérir une image structurelle.REMARQUE : Lorsque la lumière de fond est allumée, la caméra ne mesure pas une image réaliste à vie. Cependant, l’image d’intensité montre maintenant l’ensemble du champ de vision vu à travers l’optode semi-transparent. Prenez une image avec une règle ou de même dans le champ de vision pour permettre une mise à l’échelle ultérieure des images acquises. 5. Analyse des données Exportez les images de durée de vie et d’intensité de phase directement à partir du logiciel d’imagerie dédié, en utilisant la macro fournie par le fabricant de l’appareil photo. Effectuer d’autres analyses d’images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images librement disponible (voir Tableau des matériaux). Ouvrez les images de durée de vie de phase de l’étalonnage dans le logiciel d’analyse d’image et déterminez la moyenne de l’image entière à l’aide de la fonction mesure. Tracer les durées de vie mesurées par rapport aux concentrations connues d’O2 pour déterminer la fonction d’étalonnage (Figure 4A). Calculer 0/ de toutes les données(0 est la durée de vie de phase mesurée en l’absence de O2). Tracer ces valeurs par rapport aux concentrations connues d’O2 (figure 4B). Déterminer les paramètres Ksv et f de la parcelle d’étalonnage, en utilisant le modèle simplifié à deux sites pour l’étanchéité collisionnelle dynamique (équation 3)38,39 où [Q] est la concentration O2. Définissez la fonction d’ajustement dans le logiciel d’analyse de données, qui détermine ensuite Ksv et f. (3) Ouvrez les images d’échantillons acquises dans le logiciel d’analyse d’images pour convertir les durées de vie imaged en concentrations O2, en utilisant les paramètres déterminés Ksv, f et 0.REMARQUE : En tant qu’approche alternative, les valeurs de durée de vie de la phase d’étalonnage acquises (figure 4A) peuvent également être utilisées directement. Dans ce cas, un ajustement exponentiel utilisant la fonction d’ajustement de courbe est employé pour l’étalonnage. Ouvrez l’image avec la règle suivante dans le logiciel d’analyse d’image et mesurez une distance connue à l’aide de l’outil de mesure. Définir cette mesure à l’échelle mondiale sous l’échelle set.

Representative Results

Comme exemple d’application pour le nouveau système d’imagerie, nous montrons l’imagerie 2D O2 d’un échantillon biologique complexe (c.-à-d., la rhizosphère de la plante aquatique Littorella uniflora). Tout d’abord, la méthode décrit la fabrication d’un film de capteur planaire, un optode planaire. Comme on le voit dans la figure 1, un tel optode est fait d’une mince couche d’un indicateur optique dans une matrice de polymère qui est répartie sur un support transparent. En suivant le protocole décrit, un film de capteur homogène avec une épaisseur uniforme, tel que défini par l’écart du dispositif de revêtement de couteau, est obtenu. Si l’optode produit a une distribution inégale du matériau du capteur (p. ex., trous dans le revêtement, montre des rayures ou des agrégats de teinture (cela peut être évalué visuellement et visuellement à l’aide d’une lampe UV)), le protocole doit être répété et tous les matériaux doivent être soigneusement nettoyés à l’aide d’acétone. Une fois l’optode planaire préparé, l’échantillon peut être mis en contact étroit avec la couche de détection de l’optode planaire, comme le montre ici l’optode planaire intégré dans une chambre rhizo-sandwich, où les racines d’une plante dans une matrice sédimentaire environnante peuvent être placées en contact étroit avec l’optode planaire (Figure 2). Si elle est préparée correctement, la chambre rhizo-sandwich doit être facilement évolutive d’un aquarium (incubation) à l’autre (mesure). Si elle n’est pas construite correctement, la chambre rhizo-sandwich peut être instable, perdre des sédiments ou contenir des bulles d’air. L’examen visuel de la chambre rhizo-sandwich directement après l’assemblage est donc recommandé. Le protocole donné permet l’imagerie à vie de luminescence basée sur la fréquence-domaine de l’échantillon en contact avec l’optode planaire à l’aide de la caméra à vie de luminescence basée sur la fréquence-domaine. Plus de détails sur ce système de caméra tels que le mode d’acquisition d’image et scientifique complémentaire métal-oxyde-semi-conducteur (SCMOS) caractéristiques de la caméra sont donnés dans les publications récentes8,29. La configuration elle-même est assez simple et ne comprend que la caméra qui contrôle une source de lumière (dans ce cas, une source d’excitation LED) et l’échantillon avec l’optode (Figure 3). Assurez-vous que toutes les pièces sont correctement connectées et que l’échantillon est illuminé de façon homogène. La lumière de fond doit être évitée lors de la préformation des mesures. Avant d’avoir l’imagerie, l’optode doit être étalonné. Comme on le voit dans la figure 4A, la durée de vie mesurée de la luminescence diminue avec l’augmentation de la concentration d’O2 à la suite d’une carie quasi-exponentielle. Cette relation peut également être décrite à l’aide du modèle simplifié à deux sites(figure 4B et équation 3). Dans l’exemple donné, les paramètres nécessaires pour calculer ultérieurement la concentration d’O2 ont été suivis; 0 56,26 euros, Ksv 0,032 hPa-1 et f 0,86. L’exécution d’un étalonnage est également un moyen idéal de tester que le système fonctionne correctement. Si tous les composants sont installés comme décrit ici (ou dans les lignes directrices des fabricants), la durée de vie mesurée devrait montrer la même dépendance à l’O2 que la figure 4. En outre, pour la même combinaison de matériaux de détection O2 (polymère et colorant), le0 mesuré doit être dans la même plage (quelques ‘s) que mesurée ici (principalement influencée par la température expérimentale). S’il n’est pas en mesure d’obtenir une courbe d’étalonnage similaire, assurez-vous que toutes les étapes ont été suivies correctement. Parfois, l’optode est accidentellement fixé avec le côté sensible face à la paroi de verre plutôt que l’échantillon, ou les images acquises sont sur-ou sous-exposées. Avec les paramètres d’étalonnage, il est possible de déterminer la concentration d’O2 par l’imagerie de la durée de vie de la luminescence. Ceci est démontré dans la figure 5A,B, où la distribution de la concentration d’O2 dans la rhizosphère de Littorella uniflora a été représentée dans l’obscurité et après une exposition à la lumière à 500 photons m-2 s-2 pour 12 h, respectivement. En raison de l’activité photosynthétique de la plante, la concentration d’O2 dans la rhizosphère a augmenté après l’exposition à la lumière. Outre les images à vie, des images « structurelles » peuvent également être acquises sous l’éclairage externe, tout en gardant la géométrie d’imagerie fixe. De cette façon, les images O2 peuvent être précisément corrélées à l’image structurelle (figure 5C), des sections transversales ou des régions d’intérêt. À titre d’exemple, les profils de concentration O2 sur une seule racine ont été extraits de l’image acquise dans l’obscurité et la lumière, respectivement (Figure 5D). Figure 1 : Fabrication d’un optode planaire O2. (A) Une feuille de PET est fixée sur une plaque de verre et le dispositif de revêtement de couteau est placé sur le papier d’aluminium. (B) Le cocktail de capteur préparé est étalé sur le papier d’aluminium PET comme une fine ligne devant le dispositif de revêtement de couteau. (C) Le dispositif de revêtement de couteau est déplacé vers le bas pour répandre le cocktail de capteur comme un film mince sur le papier d’aluminium de PET, qui après l’évaporation de solvant a comme conséquence un optode planaire prêt à l’emploi. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Assemblage de chambre Rhizo-sandwich avec intégration d’un optode planaire O2. (A) L’optode est fixé sur l’une des plaques de verre à l’aide d’un film d’eau. (B) L’optode est collé à la plaque avec du ruban adhésif électrique. (C) Le sédiment est rempli dans la plaque opposée avec les espaceurs attachés (c.-à-d. des lames de microscope). (D) Les racines des plantes sont placées sur les sédiments uniformément étalés. (E) La chambre rhizo-sandwich est fermée et temporairement fixée avec des pinces. (F) Chambre rhizo-sandwich entièrement fermée et assemblée. (G) Pour protéger l’optode de l’exposition à la lumière par la lampe d’incubation et pour éviter la croissance des algues, un couvercle en plastique est placé au-dessus de la chambre de rhizo-sandwich assemblée. (H) La chambre rhizo-sandwich incubée dans un aquarium. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Configuration d’imagerie contenant la caméra à vie à base de luminescence basée sur le domaine de la fréquence, avec l’objectif focalisé sur l’échantillon avec l’optode par derrière via l’aquarium transparent et les murs de chambre rhizo-sandwich. Le guide lumineux de la source d’excitation LED est positionné pour éclairer l’échantillon uniformément. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Courbes de calibration pour l’optode planaire O2. (A) Différentes durées de vie de phosphorescence mesurées aux concentrations respectives d’O2 dans la chambre d’étalonnage remplie d’eau. (B) Tracestern-Volmer des données d’étalonnage équipées à l’aide du modèle simplifié à deux sites pour l’étanchéité collisionnelle dynamique (équation 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Imagerie à vie de la distribution O2 dans la rhizosphère de la plante aquatique Littorella uniflora. (A) O2 distribution après avoir gardé l’usine sous la lumière pendant 12 h à environ 500 photons m-2 s-1. (B) O2 distribution après avoir maintenu la plante dans l’obscurité pendant 1 h. (C) Image structurale des racines de la plante vue à travers l’optode planaire. (D) Profil de concentration intersectionnelle O2 (l’emplacement est indiqué par la ligne jaune dans le panneau A et B) après 12 h à la lumière (rouge) et 1 h dans l’obscurité (noir). Adapté avec la permission de (Koren, K., Moshammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kôhl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors – A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Chimie analytique. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Droit d’auteur (2019) American Chemical Society. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Dans ce protocole, l’ensemble du flux de travail de la préparation de l’optode à l’analyse d’image O₂ est couvert. En suivant ce protocole, des images chimiques peuvent être obtenues à l’aide de la nouvelle caméra à vie à base de fréquence-domaine de luminescence. Selon l’application, les optodes planaires peuvent être fabriqués dans différentes tailles et épaisseur de couche de la couche de capteur allant de robustes optodes planaires de 50-100 m d’épaisseur de plusieurs dixièmes de centimètre carré à des feuillets de couverture de microscope avec des couches de capteur d’épaisseur de ‘lt;1 ‘m⁶^,⁴⁰. Le potentiel de cette méthode a été démontré avec une application particulière, mais n’est pas seulement limité à l’imagerie O₂ dans les rhizosphères végétales¹²^,²⁸.

Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes d’imagerie chimique à base d’intensité de luminescence pure. L’imagerie à vie de Luminescence n’est pas, ou du moins beaucoup moins, affectée par l’éclairage inégal, l’épaisseur inégale d’optode, et le blanchiment de photo^25. En outre, cette méthode évite l’utilisation d’un colorant de référence supplémentaire commun dans l’imagerie ratiométrique¹⁷^,³⁷. En comparaison d’autres systèmes de caméra basés sur la durée de vie, tels que les caméras de domaine du temps couramment utilisé fermé⁸^,²⁶, le nouveau système de caméra et le protocole présenté ici peut fournir des résultats comparables. Dans une publication récente, les caractéristiques analytiques de ces deux systèmes ont été comparées et il a été constaté que le système de caméra à vie de luminescence basé sur le domaine de fréquence est au moins comparable au prédécesseur de domaine temporel interrompu⁸.

Nous avons présenté l’optode O₂ le plus simple, composé uniquement d’un indicateur dans une matrice de polymères. Outre plusieurs autres indicateurs Possibles O₂ ²⁰ qui pourraient être utilisés additifs peuvent être inclus, c’est-à-dire, les agents de diffusion tels que TiO₂ ou la poudre de diamant² pour augmenter le signal du capteur tout en réduisant la transparence de l’optode. Aussi colorants supplémentaires pourraient être utilisés pour améliorer l’intensité du signal via le transfert d’énergie⁴¹.

Pour la fabrication d’optodes planaires, nous vous recommandons d’utiliser une lacune dans le dispositif de revêtement de couteau de 75 à 120 m pour produire une épaisseur finale de couche de capteur d’environ 7,5 à 12 m après l’évaporation du solvant (environ 10 % de l’écart utilisé), lors de l’utilisation de la composition du cocktail du capteur décrit. Il s’agit d’un bon compromis entre l’intensité du signal, qui peut être modifiée par une charge de colorant plus élevée, ou en choisissant des colorants d’indicateur et de référence d’une luminosité plus élevée, et le temps de réponse. Une augmentation de l’épaisseur de la couche entraîne une augmentation du temps de réponse, car le temps requis pour que l’analyte atteigne un équilibre thermodynamique dans la couche de détection avec les médias environnants augmente^{de 12}.

Les optodes, comme décrit ici, réagissent aux changements de concentration d’O₂ en quelques secondes¹⁷ tout en ayant un signal de luminescence suffisamment fort. Les revêtements de capteur ultraminces avec des temps de réponse de moins de seconde peuvent être réalisés avec spin-coating⁶. Si le support ou le dispositif de revêtement de couteau ne sont pas bien nettoyés, il pourrait entraîner des couches de capteur inhomogènes. En outre, lorsque le cocktail n’est pas complètement homogène ou appliqué trop rapidement après la propagation devant le dispositif de revêtement un tel résultat indésirable peut être observé. Par conséquent, il pourrait avoir besoin d’une certaine pratique pour préparer des optodes optimales.

La méthode peut être utilisée pour imager des échantillons qui peuvent être mis en contact étroit avec l’optode, tels que certains animaux marins⁴², biofilms⁶ et sols³¹ pour n’en nommer que quelques-uns. Nous présentons une configuration autonome utilisant un objectif, cependant, la caméra peut facilement être couplée à un microscope pour l’imagerie chimique de plus haute résolution⁴³.

Alors que l’imagerie à vie basée sur le domaine du temps a permis la suppression de la fluorescence de fond²⁶, c’est un problème lors de l’utilisation du nouveau système de caméra basé sur la fréquence-domaine⁸. En raison de l’acquisition d’image continue, cette caméra enregistrera n’importe quelle fluorescence de fond de l’échantillon qui peut être excitée par la LED sélectionnée et émet dans la fenêtre spectrale sélectionnée telle que définie par le filtre d’émission sur l’objectif de la caméra. Cela se traduira par une durée de vie apparemment plus faible et, par conséquent, de fausses lectures. Dans le cas où vous travaillez avec des échantillons avec une fluorescence intrinsèque significative chevauchant avec l’excitation et l’émission du capteur O_2, il est essentiel d’appliquer un isolement optique supplémentaire sur le dessus de l’optode, en enrobant une couche supplémentaire contenant du noir de carbone²^,¹⁷. Ainsi, seule la luminescence émise par l’optode planaire atteindra la caméra. Afin de vérifier la luminescence de fond une image sans l’optode peut être prise, qui montrerait alors exclusivement la luminescence intrinsèque de l’échantillon. Il est également possible d’ajouter des agents de diffusion tels que TiO₂ ou poudre de diamant²^,⁴⁴, au cocktail capteur, pour augmenter l’intensité de luminescence de la teinture indicateur. Cependant, cela peut également conduire à un blanchiment photo plus rapide et TiO₂ est un photo-catalyseur connu, qui peut altérer la photostabilité d’un colorant⁴¹. Un autre aspect à considérer est la lumière de fond. Lors de la durée de vie de la luminescence d’imagerie, la lumière de fond doit être évitée aussi efficacement que possible. Par conséquent, cette méthode d’imagerie nécessite que la configuration soit placée dans un environnement sombre et que toute source de lumière externe doit être temporairement désactivée lors de l’acquisition d’images.

En résumé, l’imagerie à vie de luminescence est une méthode d’imagerie chimique robuste qui peut être adaptée à de nombreuses applications différentes. Ce protocole (voir la section 1 – 5) couvre toutes les étapes essentielles pour générer une image O₂ et utilise le système d’imagerie à vie de luminescence de la fréquence-domaine actuellement le plus flexible, qui peut remplacer la caméra de domaine temporel gated discontinuée pour l’imagerie 2D O₂ par des optodes planaires.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Sofie Lindegaard Jakobsen (Université de Copenhague) et Lars Borregaard Pedersen (Université d’Aarhus) pour leur assistance technique. Le financement de cette étude a été obtenu à partir d’une subvention de Sapere-Aude Advanced du Fonds de recherche indépendant Danemark (DFF-1323-00065B; MK), les subventions de projet de l’Independent Research Fund Danemark (fr) Sciences naturelles (DFF-8021-00308B; MK) et sciences techniques et de la production (DFF-8022-00301B et DFF-4184-00515B; MK), la Fondation nationale danoise de la recherche (DNRF136) et la Fondation Poul Due Jensen (KK).

Materials

Air pump with air stone and water pump	Local aquarium store
Chloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
DC4 silicone compound	Dow Corning GmbH	2793695
Gas mixer	Vögtlin Instruments GmbH	red-y compact meter GCM	This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices
Glass plates and aquaria	Local aquarium or hardware store
ImageJ Software	ImageJ		Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Knife-coating device	BYK-GARDNER GMBH byk.com	2021	This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.
LED lamp, Reflector PAR38	Megaman	MM17572
LED LEDHUB	Omicon Laserage, Germany		Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential
LOCTITE AA 3494	Henkel AG & Co. KGaA	NA	Acrylic-based instant adhesive
NIS Elements AR Software	Nikon Inc		Software package used for image acquisition
pco.flim	PCO AG, Germany		Frequency domain based luminescence lifetime camera
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)	Frontier Scientific	PtT975	O₂ indicator
polyethylene terephthalate (PET) foil	Goodfellow	320-992-72	Such foils might also be found from other providers and serve as solid support
Polystyrene (PS)	Sigma Aldrich	9003-53-6	Polymer matrix
Schott RG610 filter	www.uviroptics.com		Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective
Vinyl electrical tape	Scotch, Super 33+	NA
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor	delivered with the camera		Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount

Referências

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Moßhammer, M., Scholz, V. V., Holst, G., Kühl, M., Koren, K. Luminescence Lifetime Imaging of O₂ with a Frequency-Domain-Based Camera System. J. Vis. Exp. (154), e60191, doi:10.3791/60191 (2019).