I denne undersøgelse præsenterer vi inhibitor-og siRNA-baserede strategier for at forstyrre autophagic flux i herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-inficerede monocyte-afledte dendritiske celler.
Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) inducerer autophagy i begge, umodne dendritiske celler (Idc’er) samt modne dendritiske celler (mDCs), hvorimod autophagic flux kun observeret i Idc’er. For at opnå mekanistisk indsigt udviklede vi effektive strategier til at forstyrre HSV-1-induceret autophagic omsætning. En inhibitor-baseret strategi, at moduere HSV-1-induceret autophagy, udgør det første valg, da det er en nem og hurtig metode. For at omgå potentielle uspecifikke off-Target effekter af sådanne forbindelser, vi udviklet en alternativ siRNA-baserede strategi, at moduere autophagic omsætning i Idc’er ved HSV-1 infektion. Faktisk, elektroporation af idc’er med FIP200-specifikke siRNA før HSV-1 infektion er en meget specifik og vellykket metode til at afsmelte FIP200 protein ekspression og dermed hæmme autophagic flux. Begge præsenterede metoder resulterer i en effektiv hæmning af HSV-1-induceret autophagisk omsætning i Idc’er, hvorved siRNA-baserede teknik er mere målspecifik. En yderligere siRNA-baseret tilgang blev udviklet til selektivt at dæmpe protein ekspression af KIF1B og KIF2A, hvilket letter autophagisk omsætning ved HSV-1-infektion i Mdc’er. Afslutningsvis, teknikken med siRNA elektroporation repræsenterer en lovende strategi, selektivt at afsmelte udtrykket af forskellige proteiner og til at analysere deres indflydelse på en HSV-1 infektion.
Generering af humane mono byte-afledte dendritiske celler (DCs) udgør en passende in vitro-model til at studere funktioner og biologi af denne vigtige immuncelle type. Isolation og differentiering af monocytter i DCS har været veletableret i de seneste år1,2. Infektionen af DCS med α-herpesvirus herpes simplex virus type-1 (HSV-1) fungerer som et model system til at studere HSV-1-medierede modulationer af DC biologi2,3,4,5,6 . Dette er især vigtigt at belyse, hvordan herpesvira dæmpe eller hæmme potent antiviral immunrespons, at etablere ventetid i immun-privilegerede nicher inde i værten7,8. I denne henseende er herpesvira meget vellykkede patogener, der er udbredt i hele befolkningen nå en sero-prævalens på op til 90% i henhold til den geografiske region9. At forstå og muligvis forhindre dette, mere indsigt i HSV-1-mediated modulationer af værtens immunsystem, og især af immunceller som DCs, er påkrævet.
En helt ny observation vedrørende samspillet mellem DCs og HSV-1 blev for nylig udgivet af Turan et al.10. Forfatterne viste, at udførelsen af HSV-1 replikation er strengt afhængig af modnings status af DCs. I Idc’er, er komplet replikering af HSV-1 lettes ved autophagy-afhængige mekanismer. Mens HSV1 inducerer autophagy i både Idc’er og Mdc’er, observeres autophagic flux kun i Idc’er. Dette letter til gengæld nukleare udgang af virale capsid’er via autophagic nedbrydning af nukleare laminer i Idc’er. For at få mekanistisk indsigt i denne HSV-1-inducerede nedbrydnings pathway i Idc’er versus Mdc’er er nye og effektive strategier afgørende for at undersøge autophagic flux.
Macroautophagy (autophagy) er en velbevaret Step-proces, der er rettet mod intracellulære proteiner eller hele organeller til lysosomale fordøjelse11. Simplistisk kan autophagy opdeles i (i) initiering, (II) membran nukleation, (III) vesikel ekspansion, og (IV) autophagosome-lysosome fusion fase12. Under initiering (i) er komponenter som det aktiverede ULK1/2 kinase-kompleks, der indeholder det fokale adhæsion kinase-familie interagerende protein på 200 kD (FIP200), afgørende for at aktivere beclin-1-Vps34-AMBRA1-komplekset. Efterfølgende membran nukleation (II) initierer phagophore formation13, som opsluger cytoplasmiske Cargos, der er præget af molekyler som p6214. Under vesikelprotein ekspansion og autophagophore modning (III) microtubule-associeret protein lyskæde 3 (LC3)-Jeg omdannes til sin lipideret form LC3-II, der er indsat i autophagosomal membran. Således er LC3-i til-II omregningskurser en indikator for autophagy induktion ved at spejle dannelsen af modne autophagosomes15,16. Ved autophagonogle-lysosome fusion (IV), ikke kun autophagic Cargo, men også tilhørende p62 og LC3-II proteiner undergår nedbrydning (f. eks, ved hydrolyse). Således tjener tab af p62 og LC3-II som markører for autophagic flux17. Fusionen af autophagosomer med lysosomer, og dermed efter autophagic omsætning, er meget afhængig af den intracellulære lysosomale lokalisering. Dette er blandt andet reguleret af kinesin familiemedlemmer KIF1B og KIF2A, som har vist sig at have en negativ indvirkning på autophagosome-lysosome fusion18. Interessant, protein ekspression af KIF1B og KIF2A induceres ved DC modning og er dermed ansvarlig for ineffektiv autophagic flux i HSV-1-inficerede mDCs, som hæmmer komplet HSV-1 replikation10.
Eksperimentelle forsøg på at modutere autophagy omfatter brugen af forbindelser kendt for at inducere eller hæmme denne særlige vej19,20,21. I denne undersøgelse beskriver vi to inhibitor-baserede strategier til at blokere autophagic omsætning i HSV-1-inficerede Idc’er. Det første stof, der anvendes i vores eksperimenter er specifik og potent autophagy inhibitor-1 (spautin-1), som blev beskrevet for at fremme beclin-1-Vps34-AMBRA1 kompleks nedbrydning under Initierings fasen af autophagy22. Det andet stof, der anvendes i nærværende undersøgelse, er bafilomycin-a1 (BA1), en V-ATPase-hæmmer, der blokerer for de sene autophagiske hændelser (dvs. autophagosome-lysosome fusion samt autolysosome forsuring)23,24. Brugen af en af disse to hæmmere forud for iDC infektion med HSV-1 potent hæmmer autophagy, men forstyrrer ikke effektivt viral Gen ekspression. Således, denne inhibitor-baserede strategi forud for HSV-1 infektion tilbyder et kraftfuldt værktøj til at hæmme HSV-1-induceret autophagic flux, der nemt kan udvides til en overflod af forskellige celletyper og vira, som også potentielt fremkalde autophagy.
For at overvinde en stor ulempe ved en inhibitor-baseret tilgang (dvs. uspecifik off-Target effekter), vi udviklet en siRNA-baserede metode til at blokere autophagic flux i (HSV-1-inficerede) idc’er. SiRNA electroporations teknikken er en kraftfuld alternativ strategi via selektiv ablation af ekspression af forskellige proteiner (dvs. autophagic-komponenter). I vores eksperimenter blev Idc’er elektroporeret med FIP200-specifik siRNA ved hjælp af elektroporations apparatet I (Se tabel over materialer) og en modificeret protokol beskrevet af gerer et al. (2017) og Prechtel et al. (2007) for at hæmme autophagy under indledende fase25,26. Denne teknik tillod os at specifikt Knockdown FIP200 udtryk i Idc’er, uden at forstyrre cellernes levedygtighed og deres umodne fænotype to dage efter elektroporation. Bemærkelsesværdigt, HSV-1 infektion blev etableret i disse elektro porterede Idc’er spejlet af effektiv viral protein udtryk. Denne siRNA-baserede teknik giver en unik fordel (dvs. at en række forskellige autophagic komponenter, selv i kombination), kan være specifikt rettet mod ablation af deres udtryk.
I denne undersøgelse beskriver vi yderligere en siRNA-baseret metode til at inducere autophagic flux også i HSV-1-inficerede Mdc’er. I dette tilfælde blev Idc’er elektroporeret med siRNA rettet mod KIF1B og KIF2A før DC modning ved hjælp af elektro porations apparatet II (Se tabel over materialer). Da begge proteiner er upregulated under DC modning og kendt for at negativt regulere fusion af autophagosomer med lysosomer10,18, deres Knockdown kraftigt induceret autophagic flux i mdcs ved HSV-1 infektion. Den siRNA-baserede teknik gjorde det således muligt for os specifikt at fremkalde autophagisk omsætning via indblanding i KIF protein ekspression i Mdc’er og dermed kunne efterligne deres ekspressionsniveauer i Idc’erne.
Sammenfattende præsenterer vi to forskellige metoder til at hæmme autophagic flux i HSV-1-inficerede Idc’er. Mens den første inhibitor baserede tilgang udgør en nem, billig og hurtig måde at forstyrre autophagisk nedbrydning på, er den anden siRNA-baserede teknik mere specifik og en meget velegnet metode til at understøtte og verificere resultaterne af inhibitor baserede Eksperimenter. Derudover beskriver vi en metode til at inducere autophagic flux også i HSV-1-inficerede Mdc’er, via siRNA-mediated Knockdown af to KIF proteiner.
Anvendelsesområdet for denne protokol omfatter (i) håndtering af humane mono byte-afledte Idc’er samt Mdc’er, (II) deres infektion med HSV-1, (III) deres behandling med forbindelser, der vides at hæmme autophagy, og (IV) deres elektroporation med siRNA ved hjælp af to forskellige tekniske opsætninger. Ved hjælp af denne protokol kan autophagic flux enten blokeres i HSV-1-inficerede Idc’er eller induceret i HSV-1-inficerede Mdc’er.
Da DCs, og især Idc’er, er meget sårbare celler, involverer arbejdet med disse celler temmelig sarte trin. Til DC generation anbefaler vi at bruge frisk isolerede PBMCs, og for at undgå deres Kryopreservation, for at opnå højere celle udbytter. Ved håndtering af Idc’er under forsøg, herunder efterfølgende dyrkning, forhindres barske eller langvarige temperaturændringer desuden. Ellers kan Idc’er gennemgå fænotypiske ændringer, og det er derfor nødvendigt at verificere deres umodne fænotype ved flow cytometri. Bemærk, i modsætning til deres modne modparter, idc’er mangler særskilte markører, såsom CD80, CD83, og CD8628,29. Infektionen af idc’er og mdc’er med HSV-1 er en veletableret metode2,3,4,5,6,10. Vi og andre viste, at DCs er meget modtagelig for HSV-1-infektion, når der er anvendt et MOI på 1 eller 2 (figur 2). I vores hænder, at holde volumen af infektionen medium ved lave niveauer (1-3 x 106 celler i 250-350 μl) vil føre til bedre smitte effektivitet.
En klassisk tilgang til at blande sig med en given særskilt cellulære pathway er brugen af specifikke forbindelser. En række forskellige modulatorer af autophagy, dvs aktivatorer såvel som hæmmere, er i øjeblikket tilgængelige30. Med hensyn til HSV-1-induceret autophagy i DCs, Turan et al., (2019) for nylig viste de hæmmende virkninger af spautin-1 og bafilomycin-a1 (BA1) på autophagic omsætning i iDCs10. Denne teknik til autophagy hæmning er egnet til kombinationen med en efterfølgende HSV-1 infektion, da hverken infektionen sats eller modning status af DCs (især Idc’er) er forringet. I fremtidige anvendelser, denne inhibitor-baserede tilgang kan anvendes også i kombination med andre smitsomme agenser, stress betingelser, såsom sult, samt for forskellige celletyper. Ved anvendelse af inhibitorer opstår der imidlertid begrænsninger ved bestemmelsen af den passende koncentration til effektiv autophagy hæmning uden at påvirke cellernes levedygtighed alvorligt. Den største begrænsning ved brug af inhibitorer er imidlertid forekomsten af potentielle off-Target eller negative virkninger, hvilket kan føre til misvisende resultater31,32.
Den anden tilgang til at blande sig i autophagy, der er omfattet af denne protokol, er den specifikke Knockdown ved hjælp af siRNA33,34,35. På den ene side brugte vi elektroporations apparatet i til specifikt at afsmelte udtrykket FIP200 og derved hæmme HSV-1-induceret autophagisk omsætning i idc’er. På den anden side, vi tavshed to forskellige KIF proteiner (dvs., KIF1B og KIF2A), ved hjælp af elektro poration apparat II, at lette autophagic flux i HSV-1-inficerede mDCs. Begge elektro poration protokoller resulterede i en næsten fuldstændig ablation af FIP200 i Idc’er, og KIF1B/KIF2A i mDCs, som blev verificeret via Western blot analyser (figur 4a, figur 5a). I modsætning til elektroporations apparatet i, som ikke påvirker DCs ‘ levedygtighed, medfører elektro portering af Mdc’er, der anvender elektro porations apparatet II, lidt højere rater af døde celler (figur 4b, figur 5b ). Derfor, i fremtidige applikationer, den elektro poration apparat jeg bør fortrinsvis anvendes til både iDCs og mDCs. Bemærkelsesværdigt, både siRNA-baserede teknikker, at moduere autophagic flux, er kompatible med efterfølgende HSV-1 infektion af enten Idc’er eller Mdc’er. Endvidere, hverken den umodne fænotype af Idc’er eller den modne fænotype af Mdc’er er ændret post elektro poration.
Elektroporation af Idc’er ved hjælp af FIP200-specifik siRNA er en effektiv og meget specifik metode til gen-Knockdown samt hæmning af autophagic flux ved HSV-1-infektion. Ud over den specifikke hæmning af FIP200, denne protokol kan tilpasses til at lukke munden på andre autophagic komponenter, der deltager på forskellige trin under autophagic kaskade. Men at identificere det passende mål for effektiv siRNA-medieret hæmning af autophagy omfatter flere aspekter af bekymring. For det første er Knockdown effektivitet af autophagy-relaterede gener (ATG) ikke nødvendigvis positivt korreleret med effektiv hæmning af autophagy og er stærkt afhængig af det specifikke ATG-protein, der er lyddæmpet36. For det andet, særskilte ATG proteiner er desuden involveret i veje adskiller sig fra autophagy, således deres ablation kunne også føre til bivirkninger37,38,39. For det tredje kan forskellige Atg’er have overflødige funktioner, og derfor er det ikke nok med et Knockdown af en komponent at hæmme autophagy (f. eks. beclin-1 og beclin-2)40.
Desuden er det elektro porations apparat I-baserede elektroporations protokol af DCs også egnet til mRNAs, og kan anvendes til en række yderligere primære celletyper, såsom PBMCs25. Dette system giver således en generel strategi for at levere særskilte RNA-arter til forskellige primære celletyper. Afslutningsvis præsenterer vi to protokoller til at hæmme autophagic flux, ved enten at bruge en inhibitor-eller siRNA-baserede tilgang kombineret med efterfølgende HSV-1 infektion af Idc’er. Desuden beskriver vi en siRNA-elektroporations tilgang for at inducere autophagic flux i Mdc’er ved HSV-1-infektion.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det tyske Forskningsråd (DFG) via projektet STE 432/11-1, der blev tildelt AS og af ELAN-programmet fra det medicinske fakultet (Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg) via projektet 18-12-21-1, der blev tildelt LG.
4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
GM-CSF (4×104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
HLA‐DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
IL-1β (0.1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
IL-4 (1×106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
IL-6 (1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |