생체내 대식세포 모집 테스트를 위한 자궁외 체모카인 발현 모델
Summary
생체 내에서 대식세포 모집에 대한 케모카인의 효과를 시험하기 위해, 시투 혼성화에서 전체 마운트를 사용하여 케모카인의 자궁외 발현을 검출하고, 면역염색을 사용하여 대식세포에 라벨을 붙이도록 하였습니다. 라이브 이미징은 대식세포 이동의 실시간 관찰에 사용되었다.
Abstract
제브라피쉬는 기초 및 생물의학 연구에 널리 사용됩니다. 많은 제브라피쉬 형질전환 선은 현재 다양한 유형의 세포에 라벨을 붙일 수 있습니다. 제브라피시의 투명한 배아 몸으로 인해 생체 내에서 특정 유형의 세포의 행동에 대한 하나의 케모카인의 효과를 연구하는 것이 편리합니다. 여기서 우리는 생체 내에서 대식세포 마이그레이션에 대한 케모카인의 기능을 조사하는 워크플로우를 제공했습니다. 우리는 IL-34를 과발현하기 위하여 조직 특정 과발현 플라스미드를 건설하고 그의 대식세포가 형광 성 단백질에 의해 특별히 표지된 1 세포 단계 형질전환 물고기 태아로 플라스미드를 주입했습니다. 그런 다음 전체 마운트 형광을 계면 혼성화 및 면역 염색을 사용하여 케모카인 발현의 패턴과 대식세포의 수 또는 위치를 감지했습니다. 주입된 WT 배아는 안정적인 형질전환 라인을 생성하도록 제기되었다. 마지막으로, 우리는 생체 내에서 대식세포에 대한 IL-34의 기능을 연구하기 위해 안정적인 형질전환 어류에서 대식세포 거동을 직접 관찰하기 위해 공초점 라이브 이미징을 사용했습니다.
Introduction
제브라피쉬는 인도에서 유래한 작은 열대성 경뼈 민물고기입니다. 유전자 보존에 관해서는, 제브라피쉬는 인간1과87%의 유사성을 갖는다. 그것은 저희에게 유전자 조절, 단백질 기능 및 제브라피시에 있는 et.al 이동과 같은 세포 행동을 공부하여 인간의 관련 주제에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. Zebrafish 배아는 안료를 억제한 후 다른 단계에서 초기 배아의 발달을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 한편, 제브라피쉬가 성숙해지면 3개월밖에 걸리지 만, 제브라피쉬는 4일마다 수백 개의 알을 생산할 수 있습니다. 미니 크기, 간단한 번식, 강한 생식 능력, 이러한 장점은 제브라피시 문화를 매우 공간 절약, 대규모 문화에 도움이됩니다. 전통적인 포유류 모델 마우스는 제브라피시보다 유지 보수 비용이 높기 때문에 마우스 기르기의 규모를 제한합니다. 초기 배아 발달의 양태에서, 마우스 배아는 모체 자궁에서 마우스 배아 발달의 특성으로 인해 살아있는 상태에서 관찰하기 어렵다. 반대로, 제브라피시 배아는 외부에서 발달하고 투명하기 때문에 현미경으로 관찰하기 쉽습니다. 더욱이, 제브라피쉬는 관련 유전자 기능 연구를 위한 다양한 형질전환라인을 구성하기가 매우 용이하다. 현재 다양한 제브라피쉬 형질전환 라인을 사용하여 다양한 유형의 세포에 라벨을 부착할 수 있습니다. 특정 위치에서 화학모카인을 과도하게 표현하고 제브라피시의 세포 행동에 대한 케모카인 기능을 연구하기 위해 형질전환 선을 구성하는 것이 매우 편리합니다.
여기서, 우리는 생체2, 3,4,5,6,7에서대식세포 행동에 IL-34의 기능을 조사하기 위해 제브라피시 형질전환 라인을 사용하는 워크플로우를 제공했다. 첫째, 우리는 유전자 il34의 간 특이적 과발현 플라스미드를 구성하고 형광 단백질 GFP에 의해 대식세포를 특이적으로 표지한 1세포 단계 Tg(mpeg1: GFP) 물고기 배아에 플라스미드를 주입하였다. 이어서, 우리는 il34 발현의 패턴 및 대식세포의 수 또는 위치를 검출하기 위해 전체 마운트 형광을 실재화 및 면역 염색을 사용했다. 주입된 WT 배아는 안정적인 형질전환 라인을 생성하도록 제기되었다. 이 단계에서, 우리는 사이토카인 생산 라인을 설치하고 검증하고 대식세포 분포에서 볼 수 있는 효력을 시각적으로 평가했습니다. 마지막으로, 사이토카인에 반응하여 대식세포 거동을 조사하기 위해, 우리는 생체 내에서 대식세포 이동에 대한 il34의 기능을 확인하기 위해 대식세포 이동을 직접 관찰하기 위해 공초점 라이브 이미징을 사용했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 우리가 대식세포 생체의 행동에 대한 케모카인의 기능을 조사할 수 있게 해주며, 절차는 몇 가지 기술적 전문 지식이 필요합니다. 요약하면, 프로토콜내의 합병증을 피하기 위한 몇 가지 중요한 단계가 있다: 1) 관심 있는 세포를 라벨화하는 특이적이고 강한 형질전환 신호를 보여주는 적합한 형질전환 라인을 선택; 2) 이미징 및 형질전환 유전자 과발현에 접근할 수 있?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tg (fabp10a: DsRed) 형질전환 라인을 공유해 주신 징롱 펑 박사에게 감사드립니다. Tg (mpeg1: GFP) 형질전환 선을 공유하기 위한 지롱 웬 박사; pTol2 벡터를 제공하는 가와카미 고이치 박사. 이 사업은 중국 국립자연과학재단(31771594), 광동과학기술계획사업(2019A030317001), 중앙대학교 기초연구기금(D2191450)의 지원을 받았다.
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
Referências
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