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Biologia

Uma dieta sem sangue para mosquitos de anophelina traseira

Published: January 31, 2020
doi:
10.3791/60144
, , , ,
1Global Health and Tropical Medicine, GHTM, Instituto de Higiene e Medicina Tropical,Universidade Nova de Lisboa, IHMT-NOVA, 2Comparative Endocrinology and Integrative Biology, Centre of Marine Sciences,Universidade do Algarve, Campus de Gambelas

Summary

Um protocolo é apresentado para a formulação de uma dieta artificial sem sangue para alimentar mosquitos Anopheles em cativeiro. Esta dieta tem um desempenho semelhante ao sangue vertebrado e desencadeia oogênese e maturação de ovos e produz descendência adulta viável.

Abstract

A pesquisa sobre malária requer condições de reprodução e produção em larga escala para mosquitos(Anopheles spp.) em cativeiro. A produção sustentável e confiável de mosquitos é atualmente inibida pelo fornecimento de sangue vertebrado fresco. Alternativas ao sangue são necessárias para promover estratégias eficientes de controle para malária e outras doenças transmitidas por vetores que são transmitidas por insetos que alimentam sangue. Com isso em mente, dietas líquidas artificiais foram formuladas como substitutos para sangue de vertebrado fresco. Aqui relatamos uma dieta líquida artificial sem sangue que fornece taxas de alimentação semelhantes ao sangue e imita os efeitos fisiológicos de uma refeição sanguínea de vertebrado fresco. A dieta induz o amadurecimento ovariano e ovo dos mosquitos Anopheles e também produz boa sobrevivência larval e desenvolvimento de adultos funcionais. A dieta líquida formulada sem sangue é um importante avanço para a reprodução sustentável de mosquitos em cativeiro e reduzirá os custos de manutenção das colônias de mosquitos e eliminará a necessidade de sangue vertebrado fresco.

Introduction

Doenças transmitidas por vetores afetam vários milhões de seres humanos em todo o mundo e causam milhões de mortes a cada ano. Eles são transmitidos por insetos infectados com microrganismos produtores de doenças (protozoários, vírus) adquiridos quando se alimentam de sangue de um hospedeiro infectado. Posteriormente, o vetor infectado transmitirá o patógeno para um novo hospedeiro durante a próxima refeição de sangue. A malária é a doença mais mortal transmitida por vetores que é transmitida por várias espécies diferentes do mosquito Anopheles e afeta 40% da população mundial1. O parasita protista da malária é responsável por mais de 400.000 mortes por ano, das quais a maioria são crianças menores de 5 anos (Organização Mundial da Saúde). O mosquito Anopheles fêmea transmite o parasita da malária do gênero Plasmodium entre humanos e outros animais quando se alimenta de sangue vertebrado, um passo necessário para a produção e desenvolvimento de ovos2.

As estratégias atuais de erradicação da malária e outras doenças emergentes transmitidas por mosquitos vetors mortais dependem do desenvolvimento de estratégias inovadoras de controle de mosquitos3,4,5,que incluem a liberação na natureza de um grande número de mosquitos criados em insetículos. No entanto, um fator limitante crucial é a dependência de um fornecimento de sangue fresco para a criação e reprodução eficaz de mosquitos. A composição variável do sangue vertebrado pode impactar negativamente a fertilidade do mosquito e a forma física da progenia e pode limitar a confiabilidade e sustentabilidade das colônias de reprodução em cativeiro. Programas de liberação e controle de mosquitos exigem sistemas de produção de mosquitos em larga escala e um fornecimento regular de grandes quantidades de sangue vertebrado. Este é um grande obstáculo para a produção de mosquitos e levanta uma série de questões éticas associadas ao uso de animais vivos e limitações logísticas causadas pelas normas de segurança exigentes associadas. Isso torna os custos de manutenção e segurança das colônias de mosquitos elevados e desafia a sustentabilidade das práticas atuais de criação de mosquitos, particularmente em países de baixa renda, onde a ameaça da malária é muito maior.

Recentemente, pesquisas foram focadas no desenvolvimento de substitutos sanguíneos que imitam uma refeição de sangue vertebrado, mas até agora, apenas o sucesso limitado foi alcançado6,7,8,9. Uma dieta artificial bem sucedida precisa (1) provocar engorgement completo de mosquitos femininos, (2) desencadear a produção de vitellogenina, (3) produzir grandes lotes de ovos viáveis, e (4) gerar progenia saudável10. Além disso, as dietas artificiais possuem uma composição padrão e, portanto, são mais confiáveis para a produção de mosquitos para fins de pesquisa e controle. Dietas bem sucedidas sem sangue foram desenvolvidas para mosquitos Aedes (revisados por Gonzales e Hansen11),mas não para Anopheles spp. As dietas artificiais existentes contêm um phagostimulant (por exemplo, ATP10), uma fonte proteica para maturação de ovos6,12, carboidratos como fonte de energia, e aminoácidos (aa)13 que são fundamentais para a produção de óvulos e são um importante fator limitante para a fertilidade do mosquito14. Uma dieta artificial sem sangue também precisa fornecer colesterol15,o que melhora a produção de ovos. Aqui descrevemos uma dieta artificial sem sangue para mosquitos Anopheles fêmeas e demonstramos que ela tem um desempenho consistente e equivalente a uma refeição de sangue vertebrado de alta qualidade.

Protocol

Ratos foram obtidos na casa de animais IHMT. Os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com a lei portuguesa e as diretrizes para o uso de animais de laboratório. A Direção-Geral de Veterinária, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Portugal aprovou todos os protocolos de estudo (aprovações de id: 023351 e 023355). NOTA: Realize todos os ensaios alimentares em ~26 °C. 1. Mosquitos Mantenha os mosquitos Anorfeles coluzzii (antiga forma Anopheles gambiae M) Yaoundé estirpe mosquitos a 26 °C, 75% de umidade um ciclo claro de 12 h:12 h. Abrigar mosquitos usando condições insetárias padrão para garantir o acasalamento. Cole filhotes de mosquito em um pequeno recipiente de água. Coloque o recipiente dentro de uma gaiola de mosquitos para deixar os mosquitos adultos emergirem e acasalem. Forneça 10% de solução de alimentação de glicose. Três dias após o surgimento coletam o número necessário de mosquitos da gaiola usando um aspirador. Um dia antes dos ensaios alimentares, remova a solução de alimentação de 10%.NOTA: Mosquitos de 3 dias de idade foram usados ao longo dos experimentos. 2. Alimentação de mosquitos Preparação de dietas líquidas artificiais Prepare as dietas líquidas artificiais em condições estéreis em um armário de fluxo laminar. Prepare a rica dieta líquida (r-liq_diet) adicionando o seguinte à dieta líquida inicial (i-liq_diet; O meio modificado da Eagle de Dulbecco [alta glicose com L-glutamina], veja tabela 1): 0,55 g/L ATP, 1 g/L de colesterol e 200 g/L de albumina de soro bovino (BSA). Misture todos os ingredientes completamente e filtre usando um microfiltro de 0,45 μm.NOTA: Não armazene as dietas; preparar dietas recém-saídos das soluções de estoque para cada experimento, pois perdem qualidade quando armazenados. Componentes das dietas são descritos na Tabela 1. Coleta de sangue de rato Anestesia de 6 a 8 semanas de idade CD1 camundongos femininos (Mus musculus) com cetamina (120 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) utilizando a rota intraperitoneal. Realizar punção cardíaca (Figura 1) quando o rato não apresenta reação muscular em resposta a diferentes estímulos físicos (por exemplo, dores de dedo e cauda). Cole sangue usando uma seringa estéril de 1 mL com uma agulha de 27 G x 1/2 (0,4 x 12 mm2) que contém 100 μL de 1 mg/mL heparin (sal de sódio) para evitar a formação de coágulos sanguíneos. Mantenha o sangue a 37 °C usando um banho de água. Alimentação artificial Colete aproximadamente 30 mosquitos fêmeas da gaiola usando um aspirador. Transfira os mosquitos fêmeas para copos de papel de 500 mL e cubra com uma malha de rede de mosquitos fino para que eles não possam escapar. Aplique um alimentador de vidro conectado a tubos plásticos para manter um fluxo de água constante até a parte superior de cada xícara (Figura 2). Forneça um fluxo de água constante para a tubulação cilíndrica e alimentador para que a temperatura dentro seja mantida em aproximadamente 37,5 °C.NOTA: Um aparelho padrão de alimentação artificial de sino de vidro16 foi usado para fornecer as dietas formuladas aos mosquitos fêmeas. Estique a membrana de filme parafina através da boca do alimentador de vidro para conter a refeição. Pré-aqueça o i-liq_diet e o r-liq_diet a 37 °C usando um banho de água. Aplique 1 mL no alimentador de vidro. Alimente os mosquitos por 60 min no escuro com liq_diet, r-liq_diet ou sangue de rato fresco. Faça ensaios a 26 °C. Avaliação da taxa de alimentação. Após a alimentação artificial, anestesiar os mosquitos a -20 °C por 30 s. Coloque os mosquitos em uma placa de Petri refrigerada. Registre o número de mosquitos fêmeas totalmente engordados (Figura 3).NOTA: A porcentagem de mosquitos alimentados é usada como proxy para o sucesso alimentar. 3. Traços de História da Vida Produção e fertilidade de ovos Transfira as fêmeas totalmente engorgadas, usando um pincel, para gaiolas individuais (20 cm x 20 cm x 20 cm). Mantenha os mosquitos em 26 ± 1 °C, 75% de umidade e um ciclo claro de 12 h:12 h: escuro com 10% de glicose ad libitum. Quarenta e oito h após a alimentação, adicione um papel filtro umidificado na parte inferior para a colocação de ovos(Figura 4). Conte os ovos em 48h e 72 h após a adição do papel de colocação de ovos usando uma lupa portátil. Inundar o papel filtro com água destilada para coletar os ovos. Mortalidade larva Cole os ovos em bandejas (23 cm x 15 cm x 6 cm) preenchidas com água destilada(Figura 5). Mantenha o nível da água nas bandejas constantedurante os experimentos. Alimente as larvas diariamente com aproximadamente 13 mg de alimento de peixe moído por bandeja. Aplique um regime de alimentação semelhante a todas as bandejas de replicação. Remova pupas mortas e larvas diariamente. Finalize os experimentos quando todas as pupas se desenvolveram em adultos e contam o número de machos e fêmeas adultos. Registre as datas de eclosão e morte e calcule as taxas de mortalidade. Longevidade Colete 15 homens adultos e 15 fêmeas adultas da geração f1 de cada grupo de dieta. Mantenha machos e fêmeas na mesma gaiola. Alimente adultos com uma solução de glicose 10% ad libitum. Remova os adultos mortos diariamente. Mantenha os mosquitos na mesma temperatura, umidade, condições do ciclo de luz e regime de alimentação de açúcar como descrito acima. Registre as datas de morte e calcule a longevidade. Medição do comprimento da asa Mosquitos adultos f1 de cinco dias de idade (masculino e feminino) de cada grupo de dieta a -20 °C para 90 s. um estereosor, segure suavemente o tórax de cada mosquito com fórceps e coloque-os laterais ventral para cima. Colete as duas asas usando um bisturi e coloque-as em um slide de microscópio limpo contendo uma gota seca de meio de montagem. Com a ajuda de uma agulha de 20 G adicione mídia de montagem extra às bordas do deslizamento de cobertura e lentamente abaixe o deslizamento de cobertura para as asas. Meça o comprimento da asa (Figura 6) com um estereoscópio usando um micrometro.

Representative Results

Os resultados descritos abaixo comparam o desempenho de mosquitos Anopheles fêmeas alimentados com a rica refeição artificial formulada (r-liq_diet) e mosquitos alimentados com a dieta líquida inicial (i-liq_diet) ou uma refeição fresca no sangue. A dieta foi testada seguindo o protocolo esquemático retratado na Figura 7. O r-liq_diet descrito aqui faz parte de uma patente (PCT/IB2019/052967). Porcentagem de fêmeas totalmente engorgadas O número de mosquitos fêmeas engorgados alimentados com o r-liq_diet (89%) foi significativamente maior do que o número de fêmeas engorgadas alimentadas com sangue (56%) (Figura 8). Fecundidade e fertilidade A fecundidade feminina e a fertilidade para o primeiro ciclo gonotrófico foram utilizadas para avaliar a qualidade nutricional do liq_diet e r-liq_diet. Uma média de 24 ± 11 ovos foi colocado por fêmeas alimentadas com sangue de vertebrado fresco, enquanto as fêmeas alimentadas com r-liq_diet colocaram uma média de 25 ± 5 ovos (Tabela 2). Nenhuma colocação de ovos foi observada por fêmeas alimentadas com o liq_diet i. Mortalidade na F-1 A aptidão dos mosquitos F1 foi avaliada entre colônias alimentadas com sangue vertebrado ou o r-liq_diet. Foram registradas larvas, pupas e mortalidade adulta. A variabilidade (erro padrão da média [SEM]) foi maior nos mosquitos alimentados pelo sangue(Figura 9 e Tabela 2) em relação aos mosquitos alimentados com o liq_diet r. A geração f1 de mosquitos alimentados com o sangue ou o r-liq_diet tinha taxas comparáveis de mortalidade e sobrevivência. Expectativa de vida na F-1 Estima-se pelo Centro de Controle e Prevenção de Doenças que mosquitos adultos selvagens vivem por até um mês, mas provavelmente não sobrevivem por mais de 1 a 2 semanas e que os machos vivem por cerca de uma semana e se alimentam exclusivamente de néctar e outras fontes de açúcar. Observa-se que as diferenças na ingestão alimentar dos pais podem afetar a sobrevivência da progenia do mosquito17. Em nosso experimento, fêmeas adultas e machos no sangue (feminino 24,5 ± 6,8; masculino 18,5 ± 6,9) e r-liq_diet (feminino: 22,5 ± 8,1; masculino: 11,9 ± 6,9) grupos apresentaram média de expectativas de vida média semelhantes(Tabela 3) e as fêmeas apresentaram aumento de vida em relação aos machos. Tamanho do corpo da F1 O comprimento da asa foi usado como indicador do tamanho do corpo adulto. Quando comparados com outras espécies, os adultos Anopheles são mosquitos de pequeno a médio porte com comprimento de asa entre 2,8 e 4,4 mm de comprimento da asa18. O tamanho do corpo adulto dos mosquitos F1 Anopheles alimentados pelo liq_diet r estava dentro da faixa esperada e era semelhante aos mosquitos insetários alimentados pelo sangue(Figura 10). Análise estatística Os dados apresentados representam a média de pelo menos três experimentos independentes (a menos que indicado de outra forma). As barras de erro representam o SEM. Quando os dados seguiram uma distribuição gaussiana, grupos independentes foram comparados usando o teste t do Aluno, caso contrário o teste Mann-Whitney foi aplicado. As diferenças entre os grupos alimentados com dieta artificial foram analisadas por meio do teste exato do Fisher e foram consideradas significativas em P ≤ 0,05. Figura 1: Coleta de sangue do rato CD1 por punção intracárdica. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 2: Aparelho padrão de alimentação artificial. O alimentador de vidro contém r-liq_diet que está sendo alimentado com mosquitos Anopheles fêmeas. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 3: Mosquitos Anopheles após alimentação artificial. Da esquerda para a direita: uma fêmea totalmente engorgada que foi oferecida r-liq_diet, mulher não engorgada que foi oferecida r-liq_diet, macho e totalmente engorgado fêmea que foi oferecido sangue de rato. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 4: Ovos anopheles colocados 48 h pós-alimentação de fêmeas com o r-liq_diet. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 5: Etapas de larvas L2 que se desenvolveram a partir dos ovos e foram coletadas em papel filtro e colocadas em bandejas contendo água destilada. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 6: Asa direita de uma geração f1 de uma fêmea Anopheles coluzzii mosquito. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 7: Protocolo esquemático de testes de dieta artificial. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 8: As taxas de alimentação dos mosquitos fêmeas alimentaram dietas artificiais ou sangue. Asteriscos indicam diferenças significativas entre os mosquitos alimentados com as dietas r-líquido e i-líquido e o grupo de controle alimentado pelo sangue. Teste exato de Fisher de dois lados: ****P ≤ 0,0001 (risco relativo: 0,4828, 95% confiante Nível [CL]: 0,3776 a 0,6194) para dieta r-líquida versus sangue, *P = 0,0335 (risco relativo: 1.379, CL 95%: 1,044 a 1,836) para dieta líquida versus dieta líquida. Azul: não alimentado; vermelho: alimentado. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 9: Efeito da refeição formulada sem sangue na mortalidade e proporção masculino/feminina dos mosquitos F1 Anopheles coluzzii. Três experimentos independentes foram realizados, cada um usando 30 mosquitos por dieta. Um t-test não emparelhado não mostrou diferenças significativas entre o grupo alimentado pelo sangue e o grupo alimentado r-liq_diet (Valores P variaram de 0,5047 a 0,8491). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 10: Comprimento da asa. A distância da incisão axial para a veia R4+5, excluindo o conjunto de franjas, foi usada para determinar o comprimento da asa. O tamanho foi avaliado para 5 fêmeas e 5 machos de cada grupo dietético (média ± SEM). Os valores são representados como a média ± SEM. Salmão: r-liq_diet; vermelho: sangue vertebrado. Teste t não emparelhado; ala esquerda feminina: t = 1.300, df = 8, P = 0,2298; ala esquerda masculina: t = 2.400, df = 8, P = 0,0432; ala direita feminina: t = 1.300, df = 8, P = 0,2298; ala direita masculina: t = 2.277, df = 7, P = 0,0569. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Componentes g/L *Adenosine Triphosphate 0.55 *Álbum de Soro Bovino 200 *Colesterol 1 Cloreto de cálcio anidro 0.2 Cloreto de colina 0.004 Pantothenato de cálcio D (vitamina B5) 0.004 Anidro de glicose D 4.5 Nitrato ferriano nonahidrato 0.0001 Ácido fólico 0.004 Glicina 0.03 I-inositol 0.007 Monocloridor de l-arginina 0.084 Dihidrocloreto de l-cisto 0.063 L-glutamina 0.584 Monohidrato monohidrocloreto l-histidina 0.042 L-isoleucine 0.105 L-leucine 0.105 Monocloridor de l-lisina 0.146 L-methionine 0.03 L-fenillánina 0.066 L-serine 0.042 L-threonine 0.095 L-triptofano 0.016 Hidrato de sal dimorsódio l-tyrosine 0.104 L-valine 0.094 Sulfato de magnésio anidro 0.098 Niacinamida (nicotinamida) 0.004 Vermelho fenol 0.015 Cloreto de potássio 0.4 Monocloridor de piridoxina 0.004 Sal de sódio ácido piruvic 0.011 Riboflavina (vitamina B2) 0.0004 Bicarbonato de sódio 3.7 Cloreto de sódio 6.4 Anidro monobásico de fosfato de sódio 0.109 Amonoclorato de tiamina (vitamina B1) 0.004 *Somente em R-liq_diet Tabela 1: A composição da dieta i-líquida e dieta r-líquido. Número total do ovo (± SEM) Ovos/fêmea (± SEM) Sangue 733 ± 330 24 ± 11 r-liq_diet 763 ± 164 25 ± 5 i-liq_diet 0 0 Tabela 2: Lotes de ovos produzidos por fêmeas Anopheles coluzzii. Três experimentos independentes foram realizados para cada dieta experimental usando 30 mosquitos fêmeas em cada um. Fêmeas (dias ± SEM) Machos (dias ± SEM) Sangue 24,5 ± 6,8 18,5 ± 6,9 r-liq_diet 22,5 ± 8,1 11,9 ± 6,9 Tabela 3: Expectativa de vida dos mosquitos F1 Anopheles. A longevidade dos mosquitos F1 da F0 alimentada artificialmente foi avaliada registrando as datas de nascimento e morte de cada mosquito proveniente do mesmo grupo alimentar (15 fêmeas e 15 machos foram seguidas). Os resultados são representados como a média da vida útil do mosquito por grupo diet.

Discussion

O sucesso de nossa dieta formulada sem sangue é provavelmente o resultado do efeito fisiológico sinérgico de todos os componentes adicionados ao i-liq_diet (rico em açúcar, aminoácidos, vitaminas e microelementos): BSA (fonte proteica), ATP (phagostimulant) e colesterol (fonte lipídica). A suplementação do r-liq_diet apenas com os componentes individuais não foi eficaz no estímulo à produção de ovos (dados não mostrados). Uma desvantagem do protocolo pode ser o custo de alguns dos componentes, como o colesterol. Mesmo assim, sua presença é fundamental, pois os insetos são incapazes de sintetizar19 e esta molécula é o precursor dos hormônios ecdysteroidques que regulam a síntese de gema e a maturação de ovos em artrópodes20. Menores quantidades de colesterol devem ser testadas para otimizar a quantidade necessária com o objetivo de reduzir custos e aumentar os benefícios da dieta artificial.

Outra limitação do método é que a dieta artificial deve estar recém-preparada a partir de soluções de estoque, pois uma vez preparada em sua forma líquida final perde qualidade após o armazenamento. No futuro, nossa dieta formulada poderia ser preparada como uma potência seca, semelhante ao SkitoSnackt, uma substituição artificial de farinha de sangue para mosquitos Aedes aegypti 21.

Além de fornecer os nutrientes necessários, uma refeição artificial precisa atrair e estimular mosquitos fêmeas a se alimentardamente da mesma forma que quando se alimentam de sangue fresco vertebrado. A dieta artificial sem sangue aqui descrita resultou em um aumento de 20% em mosquitos fêmeas totalmente engordados quando comparado com o grupo alimentado com sangue vertebrado. Essa medida indireta de atração poderia ser ainda mais esclarecida usando olfactômetros para confirmar que a dieta artificial é mais atraente e mais atraente para os mosquitos do que o sangue fresco.

O maior impacto da dieta na mortalidade larval foi observado para larvas derivadas de mosquitos alimentados com sangue, sugerindo que uma dieta artificial de composição estável pode contribuir para reduzir a mortalidade e melhorar o sucesso da reprodução de mosquitos quando comparada ao sangue fresco. O resultado menos previsível de uma refeição sanguínea pode surgir de variações hospedeiras na composição17 e da presença no sangue de moléculas que podem interferir na fisiologia do mosquito22. Os fatos anteriores enfatizam as vantagens para a criação de mosquitos de alta qualidade de dietas sem sangue fresco.

No geral, o número médio de ovos colocados em nosso estudo foi baixo em relação aos relatados em alguns insetários, mas o número médio de ovos ovipositados foi comparável à cepa de criação de laboratório de A. gambiae alimentada com sangue humano (22,6 ± 5,5 ovos/fêmea)23. Não foram observadas diferenças estatísticas significativas entre nossos grupos experimentais alimentados com sangue fresco ou nas refeições artificiais (Tabela 2),sugerindo que a implementação de um sistema de alimentação artificial de membrana com nossa dieta formulada é suficiente para manter e propagar colônias de mosquitos Anopheles em cativeiro.

Refeições artificiais sem sangue podem manter colônias aedes 22,mas quando aplicadas aos mosquitos Anopheles são de sucesso limitado ou nenhum11. Recentemente, uma refeição artificial à base de plasma para mosquitos Anopheles foi descrita24, mas as taxas de alimentação e o potencial reprodutivo foram baixos. Nossos resultados representam um avanço substancial no estado de arte (revisado por Gonzales e Hansen11) como nosso r-liq_diet formulado teve um desempenho semelhante ou melhor do que a refeição sanguínea de vertebrado padrão. Outras melhorias na estabilidade e no custo do armazenamento devem ampliar o escopo de sua aplicação.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) pelo apoio técnico, Joana Gomes e Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) pela manutenção das colônias de mosquitos Anopheles. Financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates (OPP1138841), Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/2011, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).

Materials

Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma Aldrich A2383
BSA-Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A790G
Cholesterol MP Biomedicals 199342
Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) Lonza Bioscience BE12-604F
Entellan mounting medium Merck 1079610100
Glassfeeder Local glazier by design
Heparin Sodium Salt Pan Reac AppliChem A3004,0001
Imalgène 1000 Merial, Portugal 01MER122
Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle Terumo Europe NN-2025R
Parafilm Sigma Aldrich P6543-1EA
Rompun Bayer, Portugal 7427831
Sterilization Millex-HV 0,45 Millipore SLHVR25KS
Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle Terumo Europe BS-NIN2713
Teich Mix Astra Pond Astra 4030733100957
Tetra Goldfish Flakes Tetra 4004218742642
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Referências

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Citar este artigo
Marques, J., Cardoso, J. C. R., Félix, R. C., Power, D. M., Silveira, H. A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes. J. Vis. Exp. (155), e60144, doi:10.3791/60144 (2020).
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