Questo protocollo descrive gli esperimenti microbici sotto pressioni elevate per studiare i processi di biomining in situ. L’approccio sperimentale impiega un reattore ad alta pressione a dondolo dotato di una cellula di reazione oro-titanio contenente una coltura microbica in un mezzo acido ricco di ferro.
Studi di laboratorio che studiano i processi microbici del sottosuolo, come la lisciviazione dei metalli in depositi di minerali profondi (biomining), condividono ostacoli comuni e impegnativi, comprese le particolari condizioni ambientali che devono essere replicate, ad esempio l’alta pressione e in alcuni casi soluzioni acide. Il primo richiede una configurazione sperimentale adatta per la pressurizzazione fino a 100 bar, mentre il secondo richiede un contenitore di liquidi con elevata resistenza chimica contro la corrosione e reazioni chimiche indesiderate con la parete del contenitore. Per soddisfare queste condizioni per un’applicazione nel campo della biomining in situ, in questo studio è stata utilizzata una speciale cella di reazione oro-titanio flessibile all’interno di un reattore ad alta pressione a dondolo. Il sistema descritto ha permesso la simulazione della biomining in situ attraverso la riduzione del ferro microbico basato sul zolfo in un ambiente sperimentale anossia, controllato dalla pressione e altamente inerte chimicamente. La cella di reazione flessibile oro-titanio può ospitare fino a 100 mL di soluzione campione, che può essere campionata in qualsiasi punto temporale mentre il sistema mantiene la pressione desiderata. Gli esperimenti possono essere eseguiti su scale temporali che vanno da ore a mesi. L’assemblaggio del sistema di reattori ad alta pressione richiede molto tempo. Tuttavia, quando in laboratorio devono essere studiati processi complessi e impegnativi (microbiologici) che si verificano nel sottosuolo profondo della terra in fluidi chimicamente aggressivi, i vantaggi di questo sistema superano gli svantaggi. I risultati hanno trovato che anche ad alta pressione il consorzio microbico è attivo, ma a tassi metabolici significativamente più bassi.
Nel corso dell’ultimo decennio, gli sforzi per ridurre al minimo l’impatto dell’attività mineraria sull’ambiente sono aumentati. L’estrazione a cielo aperto per l’estrazione di materie prime di minerali (ad esempio, minerali di solfuro ricchi di rame), colpisce il paesaggio circostante dalle attività di scavo e dai grandi volumi rimanenti di rocce di scarto e resti di minerali trasformati dopo l’estrazione di preziosi metalli come il rame. L’estrazione di rame direttamente dal minerale nel sottosuolo ridurrebbe significativamente questi impatti. La tecnologia del biomining in situ è un candidato promettente per questo processo1. Questa pubblicazione descrive l’uso dell’attività microbica stimolata per estrarre i metalli preziosi dal minerale in una soluzione acquosa nel sottosuolo. Così, una soluzione ricca di rame può essere facilmente pompata di nuovo in superficie per concentrare ulteriormente il metallo, per esempio.
L’attività dei microrganismi acidofili di lisciviazione del minerale è stata studiata in molti laboratori per una vasta gamma di parametri2,3,4,5,6. Tuttavia, gli effetti di pressione sull’attività microbica derivanti dalla differenza tra le condizioni di laboratorio della superficie ambiente (vicino a 1 battuta) e il sottosuolo ad una profondità di 1.000 m con condizioni idrostatiche (100 bar) non sono ben documentati. Pertanto, gli effetti della pressione sulla riduzione del ferro microbico sono stati studiati attraverso diverse vie sperimentali7. Qui, la tecnica più adatta è descritta in dettaglio.
I reattori ad alta pressione sono stati ampiamente utilizzati per studiare le reazioni alle pressioni e alle temperature che si verificano nel sottosuolo della terra. Tali reattori sono costituiti da un recipiente di reattori sul fondo che può contenere un campione di liquido con una coltura microbica. Seduto sulla parte superiore del recipiente del reattore, la testa del reattore offre una vasta gamma di connessioni e interfacce per misure di sicurezza e sensori di monitoraggio (ad esempio, temperatura o pressione). La maggior parte dei reattori ad alta pressione sono realizzati in acciaio inossidabile. Questo materiale offre elevata resilienza e buone proprietà di lavorazione, ma la resistenza alla corrosione della superficie in acciaio inossidabile non è adeguata per ogni applicazione. Ad esempio, se si studiano soluzioni acquose altamente acide o altamente riducenti, possono verificarsi reazioni significative dei composti di interesse con la parete del reattore. Un modo per evitare questo è quello di inserire un rivestimento nel recipiente del reattore, ad esempio un rivestimento in vetro borosilicate7. È facile da pulire e può essere sterilizzato da autoclaving. Inoltre, non è attaccato da soluzioni acide o riducendo acquose. Anche se un rivestimento può aiutare a prevenire le reazioni artificiali della soluzione o dei microbi nella soluzione con la parete del reattore in acciaio inossidabile, permangono diversi problemi. Per uno, se si forma un gas corrosivo, come il solfuro di idrogeno prodotto dai batteri che riducono il solfato, questo gas potrebbe reagire con la superficie scoperta della testa del reattore seduta sopra la fodera. Un altro svantaggio è che non è possibile ritirare un campione dal reattore mantenendo la pressione.
Per superare questi limiti, sono state sviluppate cellule di reazione flessibili specializzate all’interno dei reattori ad alta pressione per una varietà di applicazioni. Una cella di politetrafluoroetilene flessibile (PTFE)8 è stata progettata per studi di solubilità dei sali nelle salamoie altamente saline. Tuttavia, la limitazione di questo sistema è che alcuni gas possono facilmente permeare il PTFE. Inoltre, questo materiale ha ancora una stabilità della temperatura relativamente bassa. Così, il sistema è stato migliorato progettando una borsa d’oro flessibile con una testa in titanio9 da posizionare all’interno del reattore ad alta pressione in acciaio inossidabile. La superficie dorata è resistente alla corrosione contro soluzioni e gas acidi o di riduzione. La superficie in titanio è anche molto inerte quando passiva accuratamente per formare uno strato di biossido di titanio continuo. Durante il campionamento da questa cella di reazione attraverso un tubo di campionamento in titanio collegato, il sacchetto d’oro si riduce in volume. La pressione interna del sistema viene mantenuta pompando lo stesso volume d’acqua, così come viene prelevato mediante campionamento, nel reattore ad alta pressione in acciaio inossidabile che ospita la cella di reazione. Il campione all’interno della cellula di reazione viene mantenuto in movimento dondolando o inclinando il reattore ad alta pressione di oltre 90 gradi durante l’esperimento.
La cella di reazione è costituita dalle parti raffigurate nella Figura 1:il sacchetto d’oro, il collare in titanio, la testa in titanio, la rondella in acciaio inossidabile, l’anello del bullone di compressione del titanio, il tubo di campionamento in titanio con ghiandole inossidabili e i collari per il cono ad alta pressione e connessioni filettate su entrambi i lati e la valvola in titanio. La borsa d’oro è una cella in oro cilindrico (Au 99,99) con uno spessore della parete di 0,2 mm, un diametro esterno di 48 mm e una lunghezza di 120 mm.
Tutte le parti in titanio sono fatte su misura dall’officina da aste di titanio di grado 2. Le dimensioni del collare, della testa, della rondella e dell’anello del bullone di compressione sono visibili nella Figura 2. Il tubo di campionamento del titanio è un capillare di titanio con un diametro esterno di 6,25 mm e uno spessore della parete di 1,8 mm, con un diametro interno di 2,65 mm. È fissato nella testa in titanio e nella valvola in titanio mediante connessioni conhoed e filettata ad alta pressione, garantendo una sigillata di superfici in titanio contro titanio. La valvola in titanio ad alta pressione è dotata di un gambo ad apertura lenta per consentire un’apertura o un campionamento molto controllato anche ad alta pressione. Questo sistema è stato utilizzato in numerosi studi10,11,12.
Il metodo presentato per esperimenti ad alta pressione di reazioni microbiche all’interno di soluzioni acide era un potente strumento per simulare processi geomicrobiologici del sottosuolo profondo in un ambiente di laboratorio.
Ci sono numerose fasi di lavoro manuale coinvolti, alcuni dei quali richiedono particolare attenzione. Come nota generale, non deve essere utilizzata alcuna forza eccessiva per assemblare le singole parti della cella flessibile oro-titanio e la testa del reattore (sezioni 3 e 4). Se le specifiche del produttore (ad esempio, per la massima pressione, temperatura, coppia) vengono ignorate, può verificarsi perdite e/o guasti del materiale.
La pulizia delle parti in oro e titanio (sezione 2.2) è una fase di lavoro indispensabile, non solo per questo esperimento, ma soprattutto per esperimenti che coinvolgono reazioni (in-)organiche. I resti di precedenti esperimenti nella cellula d’oro possono causare reazioni indesiderate e quindi distorsioni dei risultati. Quando la cella oro-titanio assemblata è installata nella testa del reattore, è meglio lavorare in modo rapido e preciso, perché in questo momento piccole quantità di ossigeno potrebbero entrare nella cella d’oro. Chiudere la valvola di campionamento prima di lasciare il glovebox è una buona prima misura per ridurre al minimo lo scambio tra l’atmosfera ambientale con l’interno della cella d’oro.
Una volta che il reattore è posizionato nel dispositivo di dondolo, è importante impostare la velocità del movimento a dondolo a . Se il reattore ad alta pressione si muove troppo velocemente, la rottura della cellula d’oro può verificarsi a causa di effetti gravitazionali o dei bordi taglienti di sedimenti o campioni di roccia quando viene utilizzato.
Questo metodo può essere utilizzato in campi di ricerca aggiuntivi. La cella di reazione flessibile oro-titanio ha il potenziale per essere utilizzata per una serie diversificata di ricerche scientifiche9 studiando le reazioni a pressione e temperatura elevate e in fluidi o gas altamente corrosivi.
I microrganismi nel sottosuolo profondo a temperature superiori ai 70 gradi centigradi in presenza di superfici minerali possono stimolare la produzione di idrogeno molecolare o acidi organici come l’acetato anche sotto pressione elevata16. Questi prodotti, e altri composti, potrebbero indurre elevata attività microbica durante i processi di bioleaching in situ, oltre ai composti di zolfo studiati in questo studio.
Le applicazioni includono la determinazione della solubilità di gas e ioni nei fluidi acquosi, le reazioni geochimiche a condizioni dei sistemi di sfiato idrotermale17, la quantificazione della frazione isotopica18, reazioni geochimiche durante il CO 2 sequestro19, processi abiotici durante la formazione di petrolio e gas nelle rocce di origine20e reazioni microbiche a pressioni elevate nel sottosuolo21 come nel presente studio.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) nel condividere la sua esperienza sulle celle di reazione flessibili oro-titanio, e Georg Scheeder (BGR) per il suo contributo durante la fase iniziale di creazione del sistema modificato ad Hannover. Ringraziamo molti scienziati (tra cui Katja Heeschen, Andreas Risse, Jens Gràger-Trampe, Theodor Alpermann) utilizzando l’allestimenti di Hannover in numerosi progetti che hanno contribuito a piccoli miglioramenti lungo la strada e Christian Seeger per lo sviluppo del per i reattori ad alta pressione. Ringraziamo Laura Castro (Complutense University of Madrid) per le osservazioni SEM. E infine, vorremmo esprimere la nostra gratitudine a Nils W’lki per la produzione di questo video di alta qualità per l’articolo. Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto BIOMOre (accordo di sovvenzione 642456) dell’Unione europea.
Acetone | Merck | 100013 | |
CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
Copper paste | Caramba | 691301 | |
Copper paste | CRC | 41520 | |
CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
HCl | Roth | 6331.3 | |
HNO3 | Fluka | 7006 | |
H3BO3 | Sigma | B6768 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
Light microscope | Leica DM3000 | ||
MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
NaO3V | Sigma | 590088 | |
Na2SO4 | Merck | 106649 | |
Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
pH meter | Mettler Toledo | ||
Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
Stoppers | Sigma | 27234 | |
Sulfur powder | Roth | 9304 | |
Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |