급성 골수성 백혈병 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질에 의한 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할 조사

1. crRNA의 디자인 웹 기반 CRISPR 설계 도구28,29,30,31을사용하여 대상 CRE의 두 crRNAs, 1개 5′ 및 다른 3’을 디자인합니다. NGG의 PAM이 Cas9 인식을 위한 대상 시퀀스의 바로 하류에 위치하도록 합니다. RUNX1 소음기(18)의 삭제를 위한 두 crRNA(crRNA-1 및 crRNA-2)의 설계는 도 1에도시되어 있다.참고: crRNA는 전형적으로 표적 서열에 상보적인 20-mer 프로토스페이서를 포함한다. 온라인 게놈 브라우저(예를 들어, NCBI 1000 게놈 또는 UCSC 게놈 브라우저)의 검색 상자에 서열의 게놈 위치를 입력하여 표적 및 인접 PAM 서열에 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)/인델의 존재를 확인한다.참고: 일반적인 SP/indels는 일반 인구에서 적어도 1%의 사소한 대말레 빈도가 있습니다. 상용 공급 업체와 합성을 위해 선택한 crRNA 서열을 제출합니다. 또한, gRNA 이중 형성을 위한 tracrRNA를 구입하십시오. 2. 삭제 스크리닝 프라이머의 설계 의도한 삭제 영역 측면에 있는 프라이머 쌍을 디자인합니다. 프라이머가 Cas9 절단 부위로부터 50bp 이상 인지 하여 PCR 증폭이 절단 부위에 형성된 인델에 의해 최소한의 영향을 받도록 한다. 앰플리온이 1,200bp보다 작아야 합니다(더 나은 크기 해상도를 위해 600bp보다 작음). 또한, 검출을 위해 5′-엔드에 형광 염료(예를 들어, 6-카르복플루오레세인(6-FAM)))로 프라이머 중 하나를 라벨을 붙입니다. RUNX1 소음기삭제(18)의 스크리닝에 사용되는 프라이머는 그림 1에나타내었다. 3. Cas9/gRNA RNP 복합체의 준비 crRNA 및 트라크RNA를 1x TE 버퍼(10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.5)에서 200 μM의 최종 농도로 재중단시켰다. 각 crRNA에 대해 2.2 μL의 200 μM crRNA, 200 μM tracrRNA의 2.2 μL 및 0.2 mL 튜브에 1x TE 버퍼 (총 10 μL)의 5.6 μL을 혼합하여 44 μM의 최종 이중 농도를 얻습니다. 95°C에서 열자전거에서 5분 동안 배양합니다. gRNA 복합체 형성을 위해 튜브를 실온으로 식힙니다. 10.4 μL의 62 μM 재조합 Cas9 뉴클레아아제를 1x 인산완충 식염수(PBS)의 7.6 μL로 희석하여 36 μM의 최종 뉴클레아제 농도를 얻었다.참고: 이 양은 2개의 Cas9/gRNA 복합체의 제조를 위해 충분하다. 3.3단계에서 수득된 각 gRNA 듀플렉스와 희석된 뉴클레아제의 동일한 부피(8.5 μL)를 혼합한다. RNP 복합체 형성을 허용하기 위해 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. 혼합물을 전기 가산 될 때까지 얼음에 보관하십시오. 4. OCI-AML3 세포로 RNP 복합체의 전기 화기 RPMI 1640 배지에서 배양 OCI-AML3 세포는 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS), 글루타맥스 100 단위/mL, 페니실린 100 μg/mL 및 스트렙토마이신 100 μg/mL(이하 완전한 RPMI 1640 배지라고 함) 5 % C5% C . 트라이판 블루 염색을 사용하여 세포를 계산합니다. 전기 천공 시 전지 생존가능성이 90% 이상인지 확인하십시오. 원심분리기 2.5 x 106 세포에서 실온에서 5 분 동안 500 x g에서 1.5 mL 튜브. 상한체를 제거하고 1 x PBS의 1 mL로 세포를 씻으하십시오. 세포를 다시 스핀 다운하고 모든 잔류 상한체를 제거하십시오. 페놀 적색 없이 RPMI 1640 배지의 163 μL에서 세포를 재중단하였다.  각 RNP 복합체의 16.7 μL(단계 3.6부터)과 100 μM 전기 천공 증강인자의 3.6 μL을 세포에 추가합니다(총 부피 = 200 μL). 파이펫팅하여 부드럽게 섞으세요.참고: 전기 개공 증강은 편집 효율을 향상시키기위한 캐리어 DNA입니다. 혼합물을 기포 없이 0.2 cm 갭 전기 큐벳으로 옮니다. 전기 천공 시스템으로 전기 천공 을 수행 (모드 : 지수; 전압 =: 150 V; 정전 용량 = 700 μF; 저항 = 50 Ω). 완전한 RPMI 1640 배지의 6 mL을 함유하는 T-25 조직 배양 플라스크에 세포를 전달하고5% CO2로 37°C에서 배양한다. 5. 바이알레트 삭제를 가진 세포 클론의 선별 그리고 선택 전기 천공 후 하루동안 완전한 RPMI 1640 배지에서 세포를 5 x 10 3/mL로 희석한다. 희석된 세포 현탁액의 100 μL을 96웰 조직 배양판의 각 웰에 넣고 세포가 7-14일 동안 자랄 수 있도록 한다. 고처리량 정제 시스템을 사용하여 세포에서 게놈 DNA를 추출합니다. 96웰 추출 플레이트의 각 웰에 100 μL의 플레이트 결합 및 용해 버퍼를 추가합니다. 버퍼에 10 μL의 10 μL에서 다시 매달린 5 x 104 셀을 추가하고 파이펫팅하여 혼합하십시오. 유전체 DNA를 웰에 결합할 수 있도록 실온에서 30분 동안 배양합니다. 우물 표면을 긁지 않고 우물에서 용액을 흡인합니다. 120 μL의 세척 버퍼로 우물을 씻으하십시오. 경계 DNA를 포함하는 우물을 공기 건조. 20 μL의 PCR 혼합물(10x 고충실도 완충제 2 μL, 50 mM MgSO4의0.8 μL, 10 mM dNTP의 0.4 μL, 10 μM FAM 표지 된 전방 프라이머의 0.4 μL (단계 2.2), 0.4 μL의 10m 비표지 역프라이머 및 0.4 μL의 각 Uq. 참고: 각 샘플에 표준화된 양의 시약이 첨가되도록 마스터 믹스를 준비합니다. 추출 플레이트의 각 웰에 PCR 혼합물을 추가하고 열사이클러에서 반응을 실행합니다(조건: 초기 94°C에서 2분, 15s의 경우 94°C의 35사이클, 30s의 경우 56°C, 1분 동안 68°C). 형광계를 사용하여 선택한 수의 샘플에서 농도를 측정하여 제품의 양을 추정합니다. 모든 시료를 뉴클레아제 프리 H2O ~ 0.5 ng/μL로 희석합니다. 희석된 PCR 제품의 1 μL을 유전 분석기와 호환되는 96웰 플레이트에 8.5 μL의 탈이온화된 포름아마이드 및 0.5 μL의 형광 염료 표지 크기 표준과 혼합합니다.참고: 탈이온화된 포름아미드와 크기 표준을 포함하는 마스터 믹스를 준비한다. 플레이트 를 중격으로 덮고 열사이클러에서 3 분 동안 95 °C에서 샘플을 변성시. 기기 뚜껑을 닫지 마십시오. 모세관 겔 전기동동을 수행하여 앞서 설명한 바와 같이 표지된 PCR 제품을분리한다(32). 전기 동동 후, 결과를 분석하기 위해 분석 소프트웨어를 엽니 다. 새 프로젝트를 클릭하고 마이크로위성을선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 프로젝트에 샘플 추가를 클릭하고 결과 파일(.fsa 확장명 포함)을 선택합니다. 그런 다음 목록에 추가를 클릭하여 파일을 가져옵니다. 선택한 결과 파일을 표시하는 표에서 분석 방법 열에서 마이크로위성 기본값을 선택합니다. 또한 크기 표준 열에 사용된 크기 표준을 선택합니다. 그런 다음 분석 아이콘을 클릭하고 실험 이름을 입력하고 실험을 저장합니다. 플롯 표시를 클릭하여 결과를 보고 플롯 설정에서 조각 해석을 선택합니다. 분석을 위해 적절한 색상 채널을 선택합니다. 주황색 아이콘을 확인하여 크기 표준의 레이블이 지정된 조각을 확인하여 크기 호출 품질을 평가합니다. 파란색 아이콘을 확인하여 레이블이 지정된 PCR 제품을 확인합니다. 야생 형 및 돌연변이 (즉, 예상 삭제를 베어링) 제품에 해당하는 피크를 식별합니다. 각 샘플의 돌연변이 수준을 야생형 및 돌연변이 피크 하에서 영역의 합으로 돌연변이 피크 아래의 영역으로 나누어 추정한다. 추가 직렬 희석에 대한 예상 삭제 수준이 높은 여러 셀 풀을 선택합니다. DNA 추출, 형광 PCR 및 모세관 전기 동아 단계를 반복합니다. 후속 분석을 위해 이중 균 탈약을 나타내는 돌연변이 수준 >95%를 가진 세포 클론을 선택합니다. Sanger 시퀀싱을 통해 선택한 클론에서 삭제의 ID를 확인합니다. 6. 실시간 정량적 RT-PCR 분석에 의한 소음기 삭제의 기능 분석 선택된 클론으로부터 총 RNA를 추출하고 상보적인 DNA(cDNA) 합성을 수행한다. RNA 1 μg를 50 μM 올리고(dT)20 μr 20 프라이머와 1 μL의 1 μL을 총 부피에서 10 μL로 혼합한 다음 65°C에서 5분 동안 얼음위에 놓습니다. 10x RT 버퍼 2 μL, 25 mM MgCl 2, 0.1 MDTT의 2 μL, RNase 억제제 1 μL (40 U/μL) 및 역전사 제라스타제 1 μL (200 U/μL)을 포함하는 cDNA 합성 믹스 10 μL을 추가합니다. 50°C에서 50분 동안 배양한 다음 85°C에서 열전도에서 5분 동안 배양합니다.참고: 역전사를 위한 마스터 믹스를 준비한다. 얼음에 샘플을 냉각. RNase H 1 μL을 넣고 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 설계 프라이머 및 TaqMan 프로브는 대체 프로모터로부터 생성된 개별 전사체 변이체를 구체적으로 인식합니다.참고: 사전 설계된 전사체 별 프라이머/프로브 세트는 시판되고 있습니다. 플라스미드 DNA로 특정 전사체 서열을 포함하는 DNA 단편을 복제한다. 재조합 플라스미드의 10배 희석 계열(10 6~10부)을 전사체 정량화를 위한 표준 곡선으로서 준비한다. 각 샘플(cDNA 및 플라스미드 표준 모두)에 대해 20 μL의 PCR 혼합물(DNA 템플릿 0.5 μL, 미리 설계된 TaqMan 프로브/프라이머 분석기 1μL 및 2x TaqMan PCR 마스터 믹스 10 μL)을 준비합니다. 각 샘플을 세 배로 측정합니다.참고: 실시간 PCR을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 실시간 PCR 기계에서 반응을 실행합니다(조건: 초기 50°C에서 2분, 10분 동안 95°C, 15s의 경우 94°C의 40사이클, 1분 동안 60°C). 증폭 후 소프트웨어의 분석 아이콘을 클릭하여 데이터를 분석합니다. 표준 곡선의 경사 및 상관 계수를 확인하여 반응의 효율및 선형성을 평가합니다. 경사가 -3.1과 -3.6 사이이고 상관 계수가 0.99보다 큰지 확인합니다. 하우스키핑 유전자(예를 들어, GAPDH)를 사용하여 각 샘플에서 표적 전사체의 카피 수를 정규화한다.