CRISPR/Cas9核糖核酸蛋白在急性骨髓性白血病细胞中的RUNX1电子消光器的转录作用研究

1. crRNA的设计 使用基于 Web 的 CRISPR 设计工具 28、29、30、31 设计两个 crRNA，一个 5’，另一个 3′ 目标 CRE。确保 NGG 的 PAM 位于 Cas9 识别的目标序列的正下游。两个crRNA（crRNA-1和crRNA-2）用于删除RUNX1消音器18的设计如图1所示。注：crRNA通常包含一个20mer原间隔器，与目标序列互补。 通过将序列的基因组位置输入在线基因组浏览器的搜索框中（例如，NCBI 1000 基因组或 UCSC 基因组浏览器），检查靶点和相邻 PAM 序列中是否存在单核苷酸多态性 （SNPs）/indels。注：普通SNPs/indels在一般人群中具有至少1%的轻微等位基因频率。 提交选定的 crRNA 序列，以便与商业供应商进行合成。此外，购买用于gRNA双工形成的tracrRNA。 2. 删除筛选引体的设计 设计一对在预定删除区域侧边引的引体。确保引体至少来自 Cas9 裂解位点 50 bp，以便 PCR 扩增受裂解部位形成的印贝的影响最小。 确保放大子小于 1，200 bp（最好小于 600 bp，以获得更好的尺寸分辨率）。此外，在 5′ 端用荧光染料（例如，6-卡博氟辛 （6-FAM）） 标记其中一个引物，以便进行检测。用于筛选RUNX1消音器删除18的引物如图1所示。 3. 制备Cas9/gRNA RNP复合物 将crRNA和tracrRNA重新悬浮在1xTE缓冲液中（10 mM Tris，0.1 mM EDTA，pH 7.5），最终浓度为200μM。 对于每个crRNA，在0.2 mL管中混合2.2μL的200μMcrRNA，2.2μL的200μMtracrRNA和5.6μL的1x TE缓冲液（总计10μL），以获得44μM的最终双工浓度。 在95°C下在热循环器中孵育5分钟。允许管冷却至室温，形成gRNA复合体。 用7.6μL的1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释10.4μL的62 μM重组Cas9核酸酶，以获得36μM的最终核酸酶浓度。注：这个量足以制备两个Cas9/gRNA复合物。 将稀释的核酸酶的等体积（8.5 μL）与步骤3.3中获得的每个gRNA双工混合。 在室温下孵育20分钟，使RNP形成复杂。将混合物留在冰上，直到电穿孔。 4. RNP复合物电穿孔到OCI-AML3电池 RPMI 1640 培养基中的 OCI-AML3 细胞辅以 10% 热灭活胎儿牛血清 （FBS）、1x 谷氨酸、100 单位/毫升青霉素和 100 μg/mL 链霉素（以下简称完整 RPMI 1640 介质），在 37°C 下，5% CO2. 使用锥蓝色染色数细胞。确保电穿孔时细胞的存活性超过90%。 在室温下，在500 x g的1.5 mL管中将2.5 x 106个细胞离心5分钟。去除上清液，用1mL的1xPBS清洗细胞。再次旋转细胞并去除所有残留的上清液。 在 163 μL 的 RPMI 1640 培养基中重新悬浮细胞，无苯酚红色。 向细胞中加入每个RNP复合物的16.7 μL（从步骤3.6开始）和3.6μL的100μM电穿孔增强剂（总体积= 200 μL）。通过移液轻轻混合。注：电穿孔增强剂是提高编辑效率的载体DNA。 将混合物转移到0.2厘米间隙电穿孔的搅拌机中，没有任何气泡。使用电穿孔系统执行电穿孔（模式：指数;电压 =： 150 V;电容 = 700 μF;电阻 = 50 Ω）。 将细胞转移到含有6mL完整RPMI 1640介质的T-25组织培养瓶中，在37°C下孵育，CO 2%为2%。 5. 筛选和选择具有双体删除的细胞克隆 电穿孔后一天，在完全 RPMI 1640 介质中将电池稀释至 5 x 103/mL。将100μL的稀释细胞悬浮液加入96孔组织培养板的每个孔中，让细胞生长7-14天。 使用高通量纯化系统从细胞中提取基因组DNA。 在 96 孔萃取板的每个孔中加入 100 μL 的板粘合和莱沙缓冲液。将5 x 104个细胞重新悬浮在10μL的1xPBS中加入缓冲液，并通过移液将其混合。 在室温下孵育30分钟，使基因组DNA与井结合。 在不刮掉井面的情况下，从井中吸出溶液。用120 μL的洗涤缓冲液清洗水井。 空气干燥含有结合DNA的井。 制备20μL的PCR混合物（2μL的10x高保真缓冲液，0.8 μL的50mMMgSO 4，0.4μL的10mM dNTPs，0.4μL的10μM FAM标记正向底漆（步骤2.2），0.4μL的10μM无标签反向底漆和0.4 U的TaqDNA聚合体每个样品。注：准备主混合物，以确保在每个样品中添加标准化数量的试剂。 将PCR混合物加入萃取板的每个井中，在热循环器中运行反应（条件：初始94°C2分钟，然后是35个周期，94°C，15秒，56°C，30秒，68°C1分钟）。 使用荧光计测量所选样品中的浓度，估计产品量。用无核酸酶 H2O 至 0.5 纳克/μL 稀释所有样品。 在与基因分析仪兼容的96孔板中，将稀释的PCR产物的1μL与8.5 μL的去离子化形式酰胺和0.5 μL荧光染料标记尺寸标准混合。注：准备一个主混合物，其中包含去离子化形式酰胺和尺寸标准。 用板隔膜盖住板，在 95°C 下在热循环器中使样品变性 3 分钟。请勿关闭机器盖。 执行毛细管凝胶电泳，以分离标签PCR产品如前所述32。 电泳后，打开分析软件分析结果。 单击”新建项目”并选择”微型卫星”。然后单击”确定”。 单击”将示例添加到项目”并选择结果文件（包含 .fsa 扩展名）。然后单击”添加到列表”以导入文件。 在显示所选结果文件的表中，在”分析方法”列中选择”微卫星默认值”。此外，选择”大小标准”列中使用的尺寸标准。然后单击”分析”图标，输入实验名称并保存实验。 单击”显示绘图”以查看结果，并在绘图设置中选择”片段分析”。 选择适当的彩色通道进行分析。检查橙色图标以查看大小标准中标记的片段，以评估大小调用的质量。 选中蓝色图标以查看标记的 PCR 产品。识别对应于野生型和突变体（即，具有预期缺失）产品的峰值。通过将突变峰下的面积除以野生型和突变峰下面积之和来估计每个样本中的突变水平。 选择具有较高预期删除级别的多个单元格池，以便进行进一步的串行稀释。 重复DNA提取、荧光PCR和毛细管电泳步骤。选择突变水平 >95% 的细胞克隆，表示双体缺失，以便后续分析。 通过 Sanger 排序验证所选克隆中删除的标识。 6. 实时定量RT-PCR分析消音器删除功能分析 从选定的克隆中提取总RNA，并进行互补DNA（cDNA）合成。 将1μgRNA与1μL的50μM寡聚物（dT）20引物和1μL的10mM dNTP混合物混合在总体积为10μL中。在65°C下孵育5分钟，然后在冰上放置至少1分钟。 加入含有2μL10x RT缓冲液、4μL25 mM MgCl 2、2 μL0.1 M DTT、1 μL RNase抑制剂（40 U/μL）和1μL逆转录酶（200 U/μL）的cDNA合成混合物。在50°C孵育50分钟，然后在热循环器中孵育5分钟，然后85°C孵育5分钟。注：为逆转录准备主混音。 在冰上冷却样品。加入1μL的RNase H，在37°C孵育20分钟，将cDNA储存在-20°C。 设计引注和 TaqMan 探头，专门识别从替代启动器生成的单个转录器变体。注：预先设计的特定于转录的引录/探针套件已上市。 将包含特定转录序列的DNA片段克隆成质粒DNA。准备10倍稀释系列（106至10份）的重组质粒作为记录量定量的标准曲线。 为每个样品制备20μL的PCR混合物（0.5 μL的DNA模板，1μL的20x预先设计的TaqMan探针/引体测定和10μL的2xTaqMan PCR主混合物）（cDNA和质粒标准）。测量三元样品。注：为实时 PCR 准备主组合。 在实时 PCR 机器中运行反应（条件：初始 50°C 2 分钟，95°C 10 分钟，然后 40 个 94 °C 循环 15 秒，60°C 1 分钟）。 放大后，单击软件中的”分析”图标以分析数据。检查标准曲线的斜率和相关系数，以评估反应的效率和线性度。确保斜率介于 -3.1 和 -3.6 之间，相关系数大于 0.99。 用内务管理基因（例如GAPDH）使每个样本中目标抄录本的副本数标准化。