JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

التحقيق في الدور النسخي لـ RUNX1 كاتم الصوت من قبل كريسبر/كاس9 ريبونوكليوبروتين في خلايا سرطان الدم النقوي الحاد

Published: September 01, 2019
doi:
10.3791/60130
, , , ,
1Blood Cancer Cytogenetics and Genomics Laboratory, Department of Anatomical and Cellular Pathology, Prince of Wales Hospital,The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory in Oncology in South China,The Chinese University of Hong Kong

Summary

التسليم المباشر لمجمعات البروتين الريبي الريبي الريبي الريبي المجمعة مسبقاً هو وسيلة سريعة وفعالة لتحرير الجينوم في خلايا المكونة للدم. هنا، نستخدم هذا النهج لحذف كاتم صوت RUNX1 intronic وفحص الاستجابات النسخية في خلايا اللوكيميا OCI-AML3.

Abstract

الجزء الأكبر من الجينوم البشري (~ 98٪) يتكون من تسلسلات غير الترميز. العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة(CREs) هي تسلسلات الحمض النووي غير الترميز التي تحتوي على مواقع ملزمة للمنظمين النسخ لتعديل التعبير الجيني. وقد تورطت في مختلف الأمراض بما في ذلك السرطان تغييرات في الـ CREs. في حين أن المروجين ومحسنات كانت CREs الأولية لدراسة تنظيم الجينات، لا يعرف سوى القليل جدا عن دور كاتم الصوت، وهو نوع آخر من CRE التي تتوسط قمع الجينات. تم استغلال CRISPR/Cas9، الذي تم تحديده في الأصل على أنه نظام مناعة متكيففي في prokaryotes، ليكون أداة قوية لتحرير الجينوم الأوكاريوتيك. هنا، نقدم استخدام هذه التقنية لحذف كاتم صوت intronic في جين RUNX1 البشري والتحقيق في الآثار على التعبير الجيني في خلايا اللوكيميا OCI-AML3. يعتمد نهجنا على تسليم اثنين من المجمعات التي تم تجميعها مسبقاً من Cas9/guide RNA (gRNA) للبروتين الريبونوكليوبروتين (RNP) لإنشاء فواصل مزدوجة حبلاً (DSBs) التي تحيط كاتم الصوت. يمكن فحص عمليات الحذف بسهولة عن طريق تحليل الأجزاء. وتساعد تحليلات التعبير لمختلف الـ mRNAs التي تنسخ من المروجين البديلين في تقييم الآثار التي تعتمد على المروجين. ويمكن استخدام هذه الاستراتيجية لدراسة الـ CREs الأخرى وهي مناسبة بشكل خاص للخلايا المكونة للدم، والتي غالباً ما يصعب نقلها باستخدام الأساليب القائمة على البلازميد. ويتيح استخدام استراتيجية خالية من البلازميد والفيروسات إجراء تقييمات بسيطة وسريعة للوظائف التنظيمية للجينات.

Introduction

عناصرCis-التنظيمية (CREs) هي تسلسلات الحمض النووي غير الترميز التي تحتويعلى مواقع ملزمة للمنظمين النسخ للتحكم في التعبير الجيني 1،2. هذه العناصر عادة ما تكون 100 إلى 1000 أزواج قاعدة (bp) طويلة. المروجين ومحسنات هي النوعين الأكثر تميزا من CREs. المروجين موجودون على مقربة من مواقع بدء النسخ وتشكل الوحدة الأساسية للنسخ. العديد من الجينات لديها أكثر من المروج واستخدامها البديل يساهم في تنوع النسخ وخصوصية الأنسجة3،4. من ناحية أخرى، محسنات تنشيط النسخ ويمكن أن يكون موجودا في المنبع، المصب أو داخل الإنترونات من الجينات المستهدفة. محسنات يمكن أن تعمل من مسافة بعيدة (أكثر من قاعدة عملاقة) ومستقلة عن التوجه1،2. كما تشمل CREs كاتم الصوت والعوازل5و6. الأول يعمل عكس القدرة على منع التعبير الجيني عن طريق ربط المثبطات النسخية، في حين أن هذا الأخير يقسم الجينوم إلى مجالات طوبولوجية منفصلة لعزل الجينات من CREs الأخرى من المجالات المجاورة. وتعمل هذه العناصر بالتنسيق مع بعضها البعض من خلال تفاعلات الكروماتين قصيرة و/أو طويلة المدى، ويتم تنظيمها في محاور تنظيمية لتوجيه التعبير الجيني الصدغي السليم. وقد أدت التطورات الأخيرة في تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية إلى تسريع عملية تحديد العديد من الـ CREs والتعليق العملي لها، مما يسر إلى حد كبير فهمنا للشبكات النسخية التي تملي الجينات الخاصة بالنسب التعبير في أنواع مختلفةمن الخلايا والأنسجة 7،8،9،10،11،12.

وبالنظر إلى الأدوار الأساسية للنظم في تنظيم النسخ، فإن تعديلاتها يمكن أن تؤدي إلى التعبير الجيني الشاذ. وقد تبين أن CREs كثيرا ما تتعطل بسبب التغيرات الوراثية والجينية في أنواع مختلفة من السرطانات البشرية، مما يسهم في بدء الورم، والتقدم والعدوانية13،14. وبالإضافة إلى ذلك، غالباً ما يتم تغيير العوامل الملزمة CRE و/أو التعبير عنها بشكل خاطئ في أنواع السرطان المختلفة، مما يسلط الضوء على أهمية إلغاء الضوابط التنظيمية CRE في التناسل15. يمكن أن تتأثر CREs أيضا بالانحرافات الهيكلية، كما يتضح من إعادة ترتيب الكروموسومات المتكررة من محسن الجينات المناعية الثقيلة (IgH) التي تؤدي إلى تنشيط غير طبيعي للأونكوجينيات المجاورة في الأورام الليمفاوية ب الخلية16. في ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML)، يؤدي تغيير موضع محسن واحد بواسطة إعادة ترتيب كروموسوم 3q إلى انخفاض تنظيم GATA2 المصاحب وتنشيط EVI1، والذي يمكن استهدافه من خلال تثبيط BET لوظائف محسن 17.في الآونة الأخيرة، ونحن تميز رواية نقل الكروموسومات التي تنطوي على اضطراب من كاتم الصوت RUNX1 intronic التي قد تسهم في تطور مكافحة غسل الأموال في مريض الأطفال18. وهكذا، فإن فك رموز جينوم السرطان غير الترميز يوفر سبلا مثمرة لتوضيح مسببات الأمراض، واكتشاف العلامات الحيوية والتدخلات العلاجية، والتي تحسن في نهاية المطاف نتائج المرضى.

تم استغلال مسار كريسبر/كاس9 nuclease، الذي تم تحديده في الأصل على أنه نظام مناعي متكيف في الخلايا البروكاريوتيكية، كوسيلة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتحرير الجينوم الخاص بالموقع في الخلايا الحية والكائنات الحية19و20 ،21،22. وينطوي نظام كريسبر/كاس9 على عنصرين رئيسيين هما: الرنا والعقدياتالمستمدة من Cas9 nuclease. يحتوي gRNA على تسلسل محدد يسمى protospacer يتعرف على المنطقة المستهدفة ويوجه Cas9 للتحرير. يتكون الرنا من جزأين: كريسبر رنا (كررنا)، وعادة ما يكون تسلسل النيوكليوتيد 20-mer مكملة للحمض النووي المستهدف، وcrRNA عبر تفعيل (تراكرنا)، والذي يعمل كسقالة ملزمة للنوكليس. وهناك حاجة إلى عزر متجاوب (PAM) (5′-NGG) بجوار الموقع المستهدف مباشرة لانشقاق Cas9 ويقع موقع الانقسام 3 نيوكليوتيدات في أعلى مجرى الجزء الأُبية. مع بلازميد الذي يشفر Cas9 وgRNA المستنسخة23. ومع ذلك، فإن هذا النهج يشكل تحديا ً للخلايا المكونة للدم، والتي غالباً ما يصعب نقلها وتتطلب أساليب طويلة للانتراب القائم على الفيروس. نهج بديل هو التسليم الخلوي المباشر من المجمعات Cas9 /gRNA RNP24. وهناك طريقة شائعة لتسليم RNP هو الكهربائي، الذي يولد المسام المؤقتة في غشاء الخلية، مما يسمح بدخول المجمعات RNP في الخلايا25،26. وتشمل مزايا هذا النهج سهولة الاستخدام، والحد من الآثار غير المستهدفة، واستقرار مجمعات البرنامج الوطني للمشاريع. هنا، ونحن نصف بروتوكول لاستخدام طريقة التسليم RNP للتحقيق في الدور النسخي من كاتم الصوت RUNX1 intronic في خط خلية سرطان الدم OCI-AML318، الذي أنشئ من الدم المحيطي لمريض مكافحة غسل الأموال تشخيص مع الفرنسية الأمريكية البريطانية M4 Subtype27. ويشمل البروتوكول تصميم crRNA، وإعداد مجمعات RNP، والكهرباء، فضلا عن فحص وتوصيف لاحق للمستنسخين المطلوبين.

Protocol

1. تصميم crRNA تصميم اثنين crRNAs، واحد 5 ‘ والآخر 3 ‘ من CRE الهدف باستخدام أداة تصميم كريسبر على شبكة الإنترنت28،29،30،31. تأكد من أن PAM من NGG يقع مباشرة المصب من التسلسل المستهدف للاعتراف Cas9. ويرد في الشكل 1تصميم الـ crRNAs اثنين (crRNA-1 وcrRNA-2) لحذف كاتم الصوت RUNX1 18.ملاحظة: يحتوي crRNA عادةً على protospacer 20-mer المكمل للتسلسل المستهدف. التحقق من وجود تعدد الأشكال النيوكليوتيدات واحد (SNPs)/indels في تسلسل اتّصال PAM المستهدف والمجاور عن طريق إدخال المواقع الجينية للتسلسلات في مربع البحث في متصفح الجينوم الإلكتروني (على سبيل المثال، الجينوم اتّباع ًا 1000 من النيوكليوتيدات أو متصفح الجينوم UCSC).ملاحظة: وللملوثات خدمة ذلك نونس/الإندلات الشائعة تردد صغير في الأليل لا يقل عن 1 في المائة في عموم السكان. إرسال تسلسل crRNA المحدد للتوليف مع بائع تجاري. أيضا، شراء التراكررنا لتشكيل دوبلكس gRNA. 2. تصميم التمهيديات فحص الحذف تصميم زوج من التمهيديات التي تحيط منطقة الحذف المقصود. تأكد من أن المواد التمهيدية هي على الأقل 50 نقطة أساس من مواقع الانقسام Cas9 بحيث يتأثر تضخيم PCR الحد الأدنى من الإندلات التي تشكلت في مواقع الانقسام. تأكد من أن amplicon أصغر من 1200 نقطة أساس (ويفضل أن يكون أصغر من 600 نقطة أساس لدقة حجم أفضل). أيضا، تسمية واحدة من التمهيديات مع صبغة الفلورسنت (على سبيل المثال، 6-carboxyfluoressin (6-FAM)) في 5’-نهاية للكشف. وترد في الشكل 1التدليلات التمهيدية المستخدمة لفحص حذف كاتم الصوت RUNX1 18. 3 – إعداد مجمعات Cas9/gRNA RNP إعادة تعليق crRNAs وtracrRNA في 1X TE العازلة (10 M Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.5) إلى تركيز نهائي من 200 درجة مئوية. لكل crRNA، مزيج 2.2 ميكرولتر من 200 ميكرومتر crRNA، 2.2 ميكرولتر من 200 ميكرومتر تراكررنا و 5.6 ميكرولتر من 1X TE العازلة (المجموع 10 ميكرولتر) في أنبوب 0.2 مل للحصول على تركيز مزدوج نهائي من 44 ميكرومتر. حضانة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في دراجة حرارية. السماح للأنابيب لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة لتشكيل مجمع gRNA. تخفيف 10.4 ميكرولتر من 62 ميكرومتر المؤتلف Cas9 nuclease مع 7.6 ميكرولتر من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) للحصول على تركيز nuclease النهائي من 36 μM.ملاحظة: ويكفي هذا المبلغ لإعداد مجمعين من المجمعات Cas9/gRNA. مزيج أحجام متساوية (8.5 درجة مئوية) من nuclease المخففة مع كل من دوبلكس gRNA التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.3. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح RNP تشكيل معقدة. يُحفظ المخاليط على الجليد حتى يتم الكهربة. 4. الكهربائي من مجمعات RNP في خلايا OCI-AML3 ثقافة OCI-AML3 الخلايا في RPMI 1640 المتوسطة تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني (FBS)، 1X GlutaMAX، 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من العقدية (يشار إليها فيما يلي باسم كامل RPMI 1640 المتوسطة) في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2. عد الخلايا باستخدام تلطيخ الأزرق تريبان. تأكد من أن قدرة الخلية على البقاء في وقت الكهرباء أكثر من 90٪. الطرد المركزي 2.5 × 106 خلايا في أنبوب 1.5 مل في 500 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant وغسل الخلايا مع 1 مل من 1X PBS. تدور أسفل الخلايا مرة أخرى وإزالة جميع supernatant المتبقية. إعادة تعليق الخلايا في 163 درجة مئوية من RPMI 1640 المتوسطة دون الفينول الأحمر.  إضافة 16.7 ميكرولتر من كل مجمع RNP (من الخطوة 3.6) و 3.6 ميكرولتر من 100 μM الكهربائي محسن إلى الخلايا (الحجم الإجمالي = 200 درجة مئوية). يُمزج بلطف عن طريق الأنابيب.ملاحظة: محسن الكهربائي هو الحمض النووي الناقل لتعزيز كفاءة التحرير. نقل الخليط إلى 0.2 سم الفجوة الكهربائية cuvette دون أي فقاعات. إجراء الكهرباء مع نظام الكهربائي (الوضع: الأسي؛ الجهد =: 150 فولت؛ السعة = 700 درجة فهرنهايت؛ المقاومة = 50 Ω). نقل الخلايا إلى قارورة زراعة الأنسجة T-25 التي تحتوي على 6 مل من RPMI 1640 كاملة المتوسطة وحضانة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. 5. فحص واختيار استنساخ الخلايا مع حذف Biallelic تمييع الخلايا إلى 5 × 103/ مل في كامل RPMI 1640 المتوسطة يوم واحد بعد الكهربائي. إضافة 100 درجة مئوية من تعليق الخلية المخففة في كل بئر من لوحات زراعة الأنسجة 96 جيدا والسماح للخلايا تنمو لمدة 7-14 يوما. استخراج الحمض النووي الجيني من الخلايا باستخدام نظام تنقية عالية الإنتاجية. إضافة 100 درجة مئوية من لوحة ملزمة والعازلة lysis إلى كل بئر من لوحة استخراج 96 جيدا. إضافة 5 × 104 الخلايا التي أعيد تعليقها في 10 μL من PBS 1X إلى المخزن المؤقت ومزجها عن طريق الأنابيب. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح لربط الحمض النووي الجيني إلى الآبار. يستنشق الحل من الآبار دون كشط أسطح الآبار. اغسل الآبار بسعة 120 لتر من مخزن الغسيل. الهواء يجف الآبار التي تحتوي على الحمض النووي ملزمة. إعداد 20 ميكرولتر من مزيج PCR (2 ميكرولتر من 10X عالية الدقة العازلة، 0.8 ميكرولتر من 50 مل مغسو4،0.4 ميكرولتر من 10 mM dNTPs، 0.4 ميكرولتر من 10 μM FAM المسمى التمهيدي إلى الأمام (الخطوة 2.2)، 0.4 ميكرولتر من 10 μM غير المسمى التمهيدي العكسي و 0.4 U من البوليمرات الحمض النووي Taq لكل عينة).ملاحظة: إعداد مزيج رئيسي لضمان إضافة كميات موحدة من الكواشف في كل عينة. إضافة مزيج PCR إلى كل بئر من لوحة استخراج وتشغيل ردود الفعل في دراجة حرارية (الشروط: الأولي 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها 35 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ق، 56 درجة مئوية لمدة 30 ق و 68 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة). تقدير كمية المنتجات عن طريق قياس تركيزاتها في عدد مختار من العينات باستخدام مقياس الفلور. تمييع جميع العينات مع H2O خالية من النوكلس إلى 0.5 نانوغرام/ميكرولتر. مزيج 1 ميكرولتر من منتجات PCR المخففة مع 8.5 ميكرولتر من الفورماميد منزوع الأيونات و 0.5 ميكرولتر من معيار الحجم الفلورسنت المسمى بالصبغة في لوحة 96-well متوافقة مع محلل الوراثية.ملاحظة: إعداد مزيج رئيسي يحتوي على الفورماميد منزوع الأيونات ومعيار الحجم. تغطية لوحة مع الحاجز لوحة وتشوه العينات في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في دراجة حرارية. لا تغلق غطاء الجهاز. إجراء الكهربائي هلام الشعرية لفصل المنتجات PCR المسمى كما سبق وصفها32. بعد الكهربائي، افتح برنامج التحليل لتحليل النتائج. انقر فوق مشروع جديد وحدد القمر الصناعي الصغير. ثم انقر فوق موافق. انقر فوق إضافة نماذج إلى Project وحدد ملفات النتائج (تحتوي على ملحق .fsa). ثم انقر فوق إضافة إلى قائمة لاستيراد الملفات. في الجدول الذي يعرض ملفات النتائج المحددة، اختر افتراضي القمر الصناعي الصغير في العمود أسلوب التحليل. أيضاً، حدد معيار الحجم المستخدم في العمود قياسي الحجم. ثم انقر على أيقونة تحليل، وأدخل اسم التجربة واحفظ التجربة. انقر فوق عرض المؤامرات لعرض النتائج واختيار تحليل الأجزاء في إعداد الرسم. اختر القنوات الملونة المناسبة للتحليل. تحقق من الرمز البرتقالي لعرض الأجزاء المسماة في معيار الحجم لتقييم جودة استدعاء الحجم. تحقق من الرمز الأزرق لعرض منتجات PCR المسماة. تحديد القمم التي تتوافق مع المنتجات البرية والمتحولة (أي تحمل الحذف المتوقع). تقدير مستوى متحولة في كل عينة عن طريق تقسيم المنطقة تحت ذروة متحولة من قبل مجموع المنطقة تحت القمم البرية والمتحولة. حدد تجمعات خلايا متعددة مع مستويات عالية من عمليات الحذف المتوقعة لمزيد من التخفيفات التسلسلية. كرر استخراج الحمض النووي، PCR الفلورسنت وخطوات الكهربائي الشعرية. حدد استنساخ الخلايا مع مستويات متحولة > 95٪ تمثل الحذف biallelic للتحليلات اللاحقة. تحقق من هوية عمليات الحذف في النسخ المحددة بواسطة تسلسل Sanger. 6. التحليلات الوظيفية لحذف كاتم الصوت عن طريق التحليل الكمي RT-PCR في الوقت الحقيقي استخراج مجموع الحمض النووي الريبي من استنساخ مختارة وإجراء الحمض النووي التكميلي (cDNA) التوليف. مزيج 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مع 1 ميكرولتر من 50 ميكرومتر oligo (dT)20 التمهيدي و 1 ميكرولتر من 10 مل dNTP مزيج في حجم إجمالي قدره 10 درجة مئوية. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج تخليق cDNA يحتوي على 2 ميكرولتر من 10X RT العازلة، 4 ميكرولتر من 25 مل مغكل2،2 ميكرولتر من 0.1 M DTT، 1 ميكرولتر من مثبطات RNase (40 U/μL) و1 ميكرولتر من النسخ العكسي (200 U/μL). حضانة في 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ثم 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في دراجة حرارية.ملاحظة: إعداد مزيج رئيسي للنسخ العكسي. اهدئي العينات على الثلج إضافة 1 درجة مئوية من RNase H وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تصميم التمهيديات وتحقيقات تقوى التي تعترف على وجه التحديد المتغيرات نسخة الفردية التي تم إنشاؤها من المروجين البديلة.ملاحظة: وتتوفر مجموعات التمهيدي/المسبار المصممة مسبقاً والمحددة للنسخ تجارياً. استنساخ شظايا الحمض النووي التي تحتوي على تسلسل نسخة محددة في الحمض النووي بلازميد. إعداد سلسلة تخفيف 10 أضعاف (106 إلى 10 نسخ) من بلازميدات المؤتلف كمنحنيات قياسية للقياس الكمي للنسخة. إعداد 20 ميكرولتر من مزيج PCR (0.5 ميكرولتر من قالب الحمض النووي، 1 ميكرولتر من 20X تصميم مسبق التحقيق طاقة / فحص التمهيدي و 10 ميكرولتر من 2X تقوى PCR ماجستير ميكس) لكل عينة (كل من cDNA ومعايير بلازميد). قياس كل عينة في ثلاثة أضعاف.ملاحظة: إعداد مزيج رئيسي لPCR في الوقت الحقيقي. تشغيل ردود الفعل في آلة PCR في الوقت الحقيقي (الشروط: الأولي 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 40 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ق و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة). بعد التضخيم، انقر فوق الرمز تحليل في البرنامج لتحليل البيانات. تحقق من الميل ومعامل الارتباط للمنحنيات القياسية لتقييم كفاءة وخطية ردود الفعل. تأكد من أن المنحدرات بين -3.1 و -3.6 ومعاملات الارتباط أكبر من 0.99. تطبيع عدد نسخ النصوص المستهدفة في كل عينة مع جين التدبير المنزلي (على سبيل المثال، GAPDH).

Representative Results

والهدف من هذه التجربة هو حذف كاتم صوت intronic في الجين RUNX1 ودراسة الآثار على النسخ RUNX1 في خلايا OCI-AML3. تم تحديد كاتم الصوت من خلال نهج جزيئي مؤتلف ووجد أنه يحتوي على عنصر أساسي 209 bp18. ولتمكين تقييم أكثر دقة لهذا العنصر الأساسي في التحكم في التعبير RUNX1، تم تصميم crRNAs (crRNA-1و crRNA-2) لاستهداف هذه المنطقة عن كثب18 (الشكل 1). وكانت مواقع الانقسام المتوقعة Cas9 التي جلبتها crRNA-1 وcrRNA-2 29 نقطةأساس و 35 نقطة أساس من العنصر الأساسي، على التوالي (الشكل 1). وتجدر الإشارة إلى أنه في حين أن مواقع PAM من crRNAs اثنين يقيمون على خيوط المعاكسة، وسوف تحدث DSBs بشكل مستقل عن موقع تسلسل PAM. وهكذا، فإن الإدخال المصاحب لمجمعين من الـ Cas9/gRNA RNP يسترشدان بـ crRNA-1 وcrRNA-2 من المتوقع أن يقتطع عنصر كاتم الصوت من موضع RUNX1. لفحص الحذف المطلوب في عدد كبير من العينات، تم استخدام شكل 96 بئر من مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي لتنقية عالية الإنتاجية. كما يمكن أن يخضع الحمض النووي المقيد على آبار لوحات الاستخراج للتضخيم المباشر، مما يقلل إلى أدنى حد من الأخطاء أو التلوث الناجم عن تكرار نقل العينات. وترد في الشكل 1التدليلات التمهيدية المستخدمة لفحص عمليات الحذف18. الحجم المتوقع للمنتج PCR البرية من النوع حوالي 500 نقطة أساس. وبما أن الحذف المقصود يمتد على 273 نقطة أساس، فمن المتوقع أن يكون المنتج المتحول حوالي 230 نقطة أساس. هذا النطاق حجم يتيح تحليل جزء بسيط وسريع عن طريق الكهربائي هلام الشعرية. تم فحص ما مجموعه 160 تجمع خلايا أولية وتم العثور على 14 لنقل الحذف المتوقع مع مستويات متحولة لا تقل عن 70٪. ثم تم اختيار خمسة برك لمزيد من التخفيفات التسلسلية لتحديد الحيوانات المستنسخة التي تحمل حذف ثنائي. يظهر في الشكل 2Aمخططات الإلكتروفر من استنساخ الخلايا مع مستويات مختلفة من المنتجات المتحولة . تم التحقق من هوية عمليات الحذف بواسطة تسلسل Sanger (الشكل2B). وكما هو متوقع، لوحظت الإندلة التي شكلتها نهاية غير متجانسة عند الانضمام إلى إصلاح DSBs33 في مواقع الانقسام المتوقعة في استنساخ الحذف. وأدى ذلك إلى تضخيم المنتجات المتحولة ذات الأحجام المختلفة، والتي يمكن أيضا الكشف عنها عن طريق الكهربائي الشعري (الشكل2ألف). يحتوي جين RUNX1 على اثنين من المروجين وهما P1 القاصي وP2 القريب، والتي يتم فصلها بواسطة إينترون كبيرة تأوي عنصر كاتم الصوت34. يتم إنتاج ثلاثة نسخ mRNA الرئيسية من قبل هؤلاء المروجين: RUNX1c من قبل P1 وRUNX1a وRUNX1b من قبل P234. تسلسل النيوكليوتيد من RUNX1c وRUNX1b متطابقة باستثناء الأول لديه فريدة من نوعها N-terminus، والتي يمكن تصميم اختبار تعبير جين تقوى محددة (الشكل3A). لقياس RUNX1b،تم استخدام اختبار TaqMan الذي يعترف بكل من RUNX1b وRUNX1c (الشكل3A). ثم تم تحديد مستويات RUNX1b عن طريق طرح إجمالي RUNX1b/RUNX1c من RUNX1c. RUNX1a هو isoform أقصر بشكل واضح بسبب الربط البديل ومعيار تقوى محدد متاح لهذا البديل (الشكل3A). وبالتالي، يمكن تحديد نشاط المروجين P1 و P2 بشكل فردي. وفي الوقت الحقيقي، أظهر الكمية RT-PCR أن حذف عنصر كاتم الصوت أدى إلى رفع مستويات التعبير عن كل من النصوص المشتقة من P1 وP2 (الشكل3باء). الشكل 1 استراتيجية لحذف كاتم الصوت RUNX1 intronic. يقع كاتم الصوت (المربع الأحمر) في الإنترون الأول من جين RUNX1 الذي يفصل بين المروجين P1 و P2 (يظهر إحداثيات hg19). تم تصميم اثنين crRNAs (crRNA-1 و crRNA-2) لإدخال DSBs المحيطة عنصر كاتم الصوت. يتم الإشارة إلى مواقع الانقسام المتوقعة Cas9 بواسطة خطوط حمراء عمودية ومواقع PAM (NGG) باللون الأرجواني. يتم تمثيل التمهيديين المستخدمة لفحص عمليات الحذف بالأسهم المفتوحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2 تعريف استنساخ الحذف: (أ) التصوير الكهربائي التمثيلي لاستنساخ الخلايا التي تظهر مستويات مختلفة من منتجات PCR المتحولة (MUT). يختلف حجم المنتجات المتحولة بين الحيوانات المستنسخة بسبب الإندلات التي تشكلت في مواقع الانقسام. WT = من النوع البري. (ب) التحقق من عمليات الحذف من النسخ المستنسخة التمثيلية بواسطة تسلسل سانجر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3 النتائج الوظيفية لحذف كاتم الصوت. (A) يتم عرض isoforms RUNX1 الرئيسية الثلاثة (RUNX1a وRUNX1b و RUNX1c). تحتوي هذه المتغيرات على نفس نطاق ربط الحمض النووي Runt ولكن مختلفة N- (البرتقالي) أو C-terminus (الأزرق). يتم الإشارة إلى موقع أزواج التحقيق /التمهيدي من طاقة بخطوط حمراء. تشير الأرقام إلى بقايا الأحماض الأمينية. (ب) تحليل RT-PCR الكمي في الوقت الحقيقي للنسخ المشتقة من RUNX1 P1 و P2 في مجموعات الخلايا مع (DEL) أو بدون (WT) الحذف ثنائي اللال11 . وقد استُخدمت الرابطة من أجل التطبيع. * و ** تشير P < 0.05 و P < 0.01, على التوالي عن طريق اختبار مان ويتني. تم تعديل هذا الرقم من تشنغ وآخرون18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد تم استخدام نظام CRISPR / Cas9 في مجموعة واسعة من تطبيقات تحرير الجينوم مثل الجينات بالضربة القاضية والدراسات ضرب في35،36، اللائحة النسخ37،38، الهندسة الوراثية لمختلف نموذج الكائنات الحية39،40،41،42،43،44 والعلاج الجيني45،46. هنا، نقوم بإظهار استخدام CRISPR/Cas9 للتحقيق في العواقب الوظيفية لحذف كاتم صوت intronic على جين RUNX1. لم يعتمد تسليم مكونات كريسبر في نهجنا على الحمض النووي البلازميد، واستنساخ الحمض النووي الريبي أو الفيروس، بل الكهربة من مجمعات Cas9/gRNA RNP المجمعة مسبقاً. وقد تبين أن استخدام الحمض النووي الخارجي يمكن أن يرتبط بالتكامل غير المرغوب فيه لتسلسلات ناقلات الأجنبية في الجينوم المضيف، وزيادة السمية وانخفاض الكفاءة25،47،48،في حين أساليب نقل الفيروس تستغرق وقتا طويلا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التعبير لفترات طويلة من Cas9 من الحمض النووي بلازميد زيادة الآثار خارج الهدف48. بل على العكس من ذلك، فقد تم وضع نهج التسليم المباشر القائم على البرنامج الوطني للشرطة الوطني بوصفه الأسلوب المفضل لأنه سريع ومباشر مع تحسين كفاءة التحرير والانتقائية وجدوى الخلايا. في الواقع، مجموعة متنوعة من الأساليب مثل lipofection49،50،الكهربائي25،51،الجسيمات النانوية52،الببتيدات اختراق الخلايا53،iTOP54 وTRIAMF تم تطوير 55 لتقديم كريسبر/كاس9 بكفاءة إلى أنواع متنوعة من الخلايا وكذلك الأنواع الحيوانية والنباتية24،25،26،56،57 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63.وبما أن تسلسلات الحمض النووي غير الترميز هي النقاط الساخنة للاختلافات الوراثية64،والتحقق من وجود SNPs المشتركة / indels في الهدف وتسلسل PAM المجاورة ذات أهمية خاصة عند تصميم gRNA التي تستهدف التنظيمية عناصر.

وينطوي الاختناق في تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 على فحص الحيوانات المستنسخة المتحولة المرغوبة في عدد كبير من العينات. لقد وظفنا PCR الفلورسنت إلى جانب الكهربائي هلام الشعرية للفحص كما الطفرة المستهدفة هو حذف الجينوم الصغيرة من حوالي 300 نقطة أساس. هذه الطريقة سريعة وحساسة ويمكن تنفيذها بطريقة عالية الإنتاجية. أيضا، هذا الأسلوب يسمح تقدير دقيق لمستويات متحولة وأحجام الحذف في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك، يتم دعم تحليل متعددة من أجزاء PCR المسمى مع أصباغ فلورية مختلفة. لقد تم استخدام هذه التقنية بشكل روتيني لجينوتايب الصغيرة الإدراج / الحذف في الأورام النخاعية65،66. في تجربتنا، يمكننا الكشف باستمرار أحجام الشظايا التي تختلف بنسبة 4 نقطة أساس بدقة عالية وعبء متحولة وصولا إلى ~ 3٪. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذه الطريقة لديها حد حجم جزء من 1200 نقطة أساس، وبالتالي فهي ليست مناسبة لفحص عمليات الحذف الكبيرة. كما لا يمكن الكشف عن البدائل الأساسية (التي تؤدي إلى عدم تغيير حجم الأجزاء) والأحداث المحتملة غير المستهدفة في مناطق جينية أخرى. وبالنسبة لهذه الأخيرة، فإن تسلسل الجينوم بأكمله المكلف مطلوب للتعريف الشامل بالتغيرات العالمية غير المرغوب فيها في عمليات الاستنساخ المستهدفة. اعتماد نهجنا الحالي للتحقيق في التسلسلات التنظيمية الكبيرة غير الترميز (>1,000 bp), حذف مفصل وتحليلات الطفرات من مواقع ربط عامل النسخ المفترض باستخدام الاختبارات الجينية في المختبر مراسل يمكن أن يؤدي مسبقا لتحديد المنطقة الوظيفية الحد الأدنى لCRISPR / Cas9 التحرير18.

وبما أن العديد من الجينات تحتوي على أكثر من مروّجواحد 3و4،فمن المهم أن تكون على بينة من وجود المروجين البديلين في موضع الجينات المستهدفة لأن التلاعب بالعناصر التنظيمية قد يؤثر على المروجين بشكل تفاضلي. وبالتالي، فإن متغيرات النسخ المستمدة من مروّجين مختلفين تحتاج إلى قياس فردي لتقييم أي ردود خاصة بالمروجين. ويُفضّل استخدام الاختبارات المستندة إلى التحقيق في “تُكِمان” على “سي بي آر غرين” بسبب خصوصية أفضل وإمكانية استنساخ. إذا كان نظام PCR الرقمي الأكثر تقدماً متوفراً، يمكن إجراء التحديد الكمي للنسخ بشكل أكثر دقة دون الحاجة إلى بناء منحنى قياسي.

ومن الاعتبارات الهامة في إجراء تجارب كريسبر/كاس9 في خطوط الخلايا السرطانية رقم نسخ الجينات المستهدفة في الخلايا المستخدمة كجميع خطوط الخلايا السرطانية تقريباً تحتوي على تغييرات جينية بما في ذلك الاختلافات الهيكلية وتغيرات عدد النسخ. في حالتنا، OCI-AML3 لديه نوع كاريوتيبي فرط ثنائي مع 45 إلى 50 كروموسوم. أيضا، تم العثور على خط الخلية لحمل رقم نسخة RUNX1 العادي كما هو الحال في موسوعة خط الخلايا السرطانية67 والفلورة في دراسات التهجين الموقع18. عند استهداف جين مع كسب رقم نسخة، قد تحتاج طريقة التسليم إلى تحسين لتوفير مستويات كافية من مكونات CRISPR للتحرير. أيضا، قد تحتاج إلى مزيد من استنساخ ليتم فحصها من أجل تحديد بالضربة القاضية كاملة. والأهم من ذلك، فقد تبين أن الاستهداف في المناطق الجينية المضخمة، ولا سيما تلك الناجمة عن إعادة الترتيب الهيكلي، يمكن أن يؤدي إلى استجابات مضادة للانتشار مستقلة عن الجينات في الخلايا السرطانية، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة في الجينات الدراسات الوظيفية68،69،70. وفي هذا الصدد، ينبغي استخدام نُهج بديلة مثل تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) و/أو التعبير المفرط للحمض النووي الريبي للتحقق من نتائج كريسبر. أيضا، يجب استخدام خطوط الخلايا متعددة لتجنب سوء تفسير خط الخلية محددة ولكن الجينات المستقلة كريسبر آثار التحرير.

أحدث نظام CRISPR/Cas9 ثورة في البحوث الأساسية والترجمة من خلال توفير وسيلة بسيطة وفعالة لتحرير الجينوم. هنا نبرهن على سهولة استخدام CRISPR/Cas9 لتعطيل كاتم الصوت غير التروني للدراسات النسخية في خط الخلايا السرطانية. تسمح هذه التقنية لدراسة CREs على مستوى الحمض النووي وتوفر الفرص لفحص وظائف CRE في السياق المحلي بدلاً من الجينات مراسل غير متجانسة التقليدية. وفي الآونة الأخيرة، تم أيضاً تحديد نظام تحرير الحمض النووي الريبي القائم على كريسبر71 وقد يكون بمثابة أداة جديدة لدراسة الـ CREs من خلال استهداف الحمض النووي الريبي المنقول من العناصر التنظيمية. ومن خلال الجمع بين تقنيات التقاط المطابقة للكروموسوم، سيساعد CRISPR/Cas9 بالتأكيد على فك رموز مشاركة الـ CREs في تنظيم الجينوم المتغير والتعبير الجيني المرتبط بمختلف المشاكل الصحية.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويود المؤلفان أن يشكرا البروفيسور م. د. ميندن (مركز الأميرة مارغريت للسرطان، الشبكة الصحية الجامعية، تورنتو، كندا) على توفير خط الخلية OCI-AML3. كما يود المؤلفون أن يشكروا المرافق الأساسية لعلم الجينوم السرطاني وعلم الأمراض (الجامعة الصينية في هونغ كونغ) على توفير التسهيلات والمساعدة لدعم هذا البحث.

Materials

0.2 cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad 1652086
1×TE buffer, pH7.5 Integrated DNA Technologies 11-01-02-02
10mM dNTP mix Thermo Fisher Scientific 18427013
3500 Genetic Analyzer Thermo Fisher Scientific 4405673
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer Thermo Fisher Scientific None
7300 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific None
7300 System SDS Software Thermo Fisher Scientific None Version 1.3.1
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system Bio-Rad 1652660
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well Thermo Fisher Scientific CS11205
crRNA-1 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
crRNA-2 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
Deionized formamide Thermo Fisher Scientific 4311320
Electroporation Enhancer Integrated DNA Technologies 1075915
fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270098
Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32857
GeneMapper Software 5 Thermo Fisher Scientific 4475073
GeneScan 600 LIZ Size Standard Thermo Fisher Scientific 4408399
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
PBS, 10X Solution, pH7.4 Affymetrix 75889
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher Scientific 11304029
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease Integrated DNA Technologies 1081058 Components of the Cas9/gRNA complex
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 31800-022
RPMI 1640 medium without phenol red Thermo Fisher Scientific 11835030
RUNX1a TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs04186042_m1
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs00231079_m1
RUNX1c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs01021966_m1
SuperScript III First-Strand Synthesis System Thermo Fisher Scientific 18080051
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4304437
tracrRNA Integrated DNA Technologies 1072533 Components of the Cas9/gRNA complex
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Unlabeled PCR reverse primer Thermo Fisher Scientific None
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Maston, G. A., Evans, S. K., Green, M. R. Transcriptional regulatory elements in the human genome. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 29-59 (2006).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nature Reviews Genetics. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Research. 16 (1), 55-65 (2006).
  4. Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends in Genetics. 19 (11), 640-648 (2003).
  5. West, A. G., Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: many functions, many mechanisms. Genes & Development. 16 (3), 271-288 (2002).
  6. Riethoven, J. J. Regulatory regions in DNA: promoters, enhancers, silencers, and insulators. Methods in Molecular Biology. 674, 33-42 (2010).
  7. Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  8. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  9. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  10. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  11. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  12. Bernstein, B. E., et al. The NIH roadmap epigenomics mapping consortium. Nature Biotechnology. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  13. Zhou, S., Treloar, A. E., Lupien, M. Emergence of the Noncoding Cancer Genome: A Target of Genetic and Epigenetic Alterations. Cancer Discovery. 6 (11), 1215-1229 (2016).
  14. Khurana, E., et al. Role of non-coding sequence variants in cancer. Nature Reviews Genetics. 17 (2), 93-108 (2016).
  15. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Molecular Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  16. Willis, T. G., Dyer, M. J. The role of immunoglobulin translocations in the pathogenesis of B-cell malignancies. Blood. 96 (3), 808-822 (2000).
  17. Gröschel, S., et al. A single oncogenic enhancer rearrangement causes concomitant EVI1 and GATA2 deregulation in leukemia. Cell. 157 (2), 369-381 (2014).
  18. Cheng, C. K., et al. RUNX1 upregulation via disruption of long-range transcriptional control by a novel t(5;21)(q13;q22) translocation in acute myeloid leukemia. Molecular Cancer. 17 (1), 133 (2018).
  19. Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  20. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual Review of Genetics. 45, 273-297 (2011).
  21. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  22. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  23. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  24. Cho, S. W., Lee, J., Carroll, D., Kim, J. S., Lee, J. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Genética. 195 (3), 1177-1180 (2013).
  25. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  26. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, 04766 (2014).
  27. Quentmeier, H., et al. Cell line OCI/AML3 bears exon-12 NPM gene mutation-A and cytoplasmic expression of nucleophosmin. Leukemia. 19 (10), 1760-1767 (2005).
  28. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  29. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  30. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  31. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  32. Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A. M., Li, S. Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format. Journal of Visualized Experiments. (122), e55586 (2017).
  33. Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  34. Sood, R., Kamikubo, Y., Liu, P. Role of RUNX1 in hematological malignancies. Blood. 129 (15), 2070-2082 (2017).
  35. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  36. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  37. Wright, J. B., Sanjana, N. E. CRISPR Screens to Discover Functional Noncoding Elements. Trends in Genetics. 32 (9), 526-529 (2016).
  38. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  39. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  40. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  41. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genética. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  42. Chen, C., Fenk, L. A., de Bono, M. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans by CRISPR-targeted homologous recombination. Nucleic Acids Research. 41 (20), 193 (2013).
  43. Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, 16 (2015).
  44. Svitashev, S., et al. Targeted Mutagenesis, Precise Gene Editing, and Site-Specific Gene Insertion in Maize Using Cas9 and Guide RNA. Plant Physiology. 169 (2), 931-945 (2015).
  45. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  46. Ye, L., et al. Genome editing using CRISPR-Cas9 to create the HPFH genotype in HSPCs: An approach for treating sickle cell disease and β-thalassemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10661-10665 (2016).
  47. Gabriel, R. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nature Biotechnology. 29 (9), 816-823 (2011).
  48. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nature Methods. 9 (8), 805-807 (2012).
  49. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
  50. Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (11), 2868-2873 (2016).
  51. Gundry, M. C., et al. Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9. Cell Reports. 17 (5), 1453-1461 (2016).
  52. Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
  53. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
  54. D’Astolfo, D. S., et al. Efficient intracellular delivery of native proteins. Cell. 161 (3), 674-690 (2015).
  55. Yen, J., et al. TRIAMF: A New Method for Delivery of Cas9 Ribonucleoprotein Complex to Human Hematopoietic Stem Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16304 (2018).
  56. Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
  57. Martin, A., et al. CRISPR/Cas9 mutagenesis reveals versatile roles of Hox genes in crustacean limb specification and evolution. Current Biology. 26 (1), 14-26 (2016).
  58. Menoret, S., et al. Homology-directed repair in rodent zygotes using Cas9 and TALEN engineered proteins. Scientific Reports. 5, 14410 (2015).
  59. Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
  60. Malnoy, M., et al. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. Frontiers in Plant Science. 7, 1904 (2016).
  61. Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
  62. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 7, 13274 (2016).
  63. Shin, S. E., et al. CRISPR/Cas9-induced knockout and knock-in mutations in Chlamydomonas reinhardtii. Scientific Reports. 6, 27810 (2016).
  64. 1000 Genomes Project Consortium et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  65. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. The New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  66. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations fro an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
  67. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
  68. Aguirre, A. J., et al. Genomic Copy Number Dictates a Gene-Independent Cell Response to CRISPR/Cas9 Targeting. Cancer Discovery. 6 (8), 914-929 (2016).
  69. Munoz, D. M., et al. CRISPR Screens Provide a Comprehensive Assessment of Cancer Vulnerabilities but Generate False-Positive Hits for Highly Amplified Genomic Regions. Cancer Discovery. 6 (8), 900-913 (2016).
  70. Gonçalves, E., et al. Structural rearrangements generate cell-specific, gene-independent CRISPR-Cas9 loss of fitness effects. Genome Biology. 20 (1), 27 (2019).
  71. Abudayyeh, O. O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).

Tags

Keyword Extraction:RUNX1Intronic SilencerCRISPR/Cas9 RibonucleoproteinAcute Myeloid LeukemiaCis-regulatory ElementsGene ExpressionTranscriptional RoleHematopoietic CellsElectroporationCas9 NucleaseGRNARNP ComplexFragment Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Cheng, C., Wong, T. H., Yung, Y., Chan, N. C., Ng, M. H. Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (151), e60130, doi:10.3791/60130 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image