金属イオン認識の構造とメカニズムを決定するイオン移動質量分析技術と金属結合オリゴペプチドの酸化還元活性
Summary
イオンモビリティ質量分析および分子モデリング技術は、設計された金属結合ペプチドおよび銅結合ペプチドメタノバクチンの選択的金属キレート性能を特徴付けることができる。金属キレートペプチドの新しいクラスを開発することは、金属イオンの不均衡に関連する疾患の治療につながるのに役立ちます。
Abstract
エレクトロスプレーイオン化(ESI)は、質量、全体的な電荷、金属結合相互作用、および立体形状を節約しながら、水相ペプチドまたはペプチド複合体をガス相に移すことができる。ESIとイオンモビリティ質量分析(IM-MS)の結合は、その状態測定、プロトネーション状態に関連するペプチドの質量対電荷(m/z)および衝突断面(CCS)の同時測定を可能にする器械的な技術を提供し、そして立体形状。ペプチド複合体の全体的な電荷は、1)ペプチドの酸性および塩基部位および2)金属イオンの酸化状態のプロトン化によって制御される。したがって、複合体の全体的な電荷状態は、ペプチド金属イオン結合親和性に影響を与える溶液のpHの関数である。ESI-IM-MS分析では、ペプチドおよび金属イオン溶液は水性のみの溶液から調製され、pHは希希水性酢酸または水酸化アンモニウムで調整されます。これにより、pH依存性および金属イオン選択性を特定のペプチドに対して決定することができる。さらに、ペプチド複合体のm/zおよびCCSは、B3LYP/LanL2DZ分子モデリングと共に、複合体の金属イオン協調および三次構造の結合部位を識別するために使用することができる。結果は、ESI-IM-MSが一連の代替メタノバクチンペプチドの選択的キレート性能を特徴付け、銅結合ペプチドメタノバクチンと比較する方法を示した。
Introduction
銅イオンと亜鉛イオンは、生物に不可欠であり、酸化保護、組織成長、呼吸、コレステロール、グルコース代謝、ゲノム読み取り1を含むプロセスに不可欠です。これらの機能を有効にするために、シスのチオレート、彼の2、3のイミダゾール、(よりまれに)メチオニンのチオエーテル、およびGluとAspのカルボキシレートは、選択的に金属を活性化部位に組み込む。メタロエンザイム。これらのコーディネーショングループの類似性は、HisおよびCysリガンドが正しい機能を確保するためにCu(I/II)またはZn(II)のいずれかを選択的に組み込む方法に関する興味深い疑問を提起する。
選択的結合は、多くの場合、Zn(II)またはCu(I/II)イオン濃度4を制御するペプチドの獲得および密売によって達成される。Cu(I/II)は反応性が高く、酵素に酸化的損傷や急激な結合を引き起こすため、その自由濃度は、細胞内の様々な場所に安全に輸送する銅シャペロンおよび銅調節タンパク質によって厳しく調節される。その恒常主義を制御する 5,6.銅代謝または恒常性の破壊は、メンケスおよびウィルソン病7ならびに癌7およびプリオン8およびアルツハイマー病9などの神経疾患に直接関与する。
ウィルソン病は、目、肝臓、脳のセクションの銅レベルの増加に関連しており、Cu(I/II)の酸化還元反応が活性酸素種を産生し、肝無胞および神経変性を引き起こす。既存のキレート療法は、小さなチオールアミノ酸ペニシラミンおよびトリエチレネテトラミンである。あるいは、メタノトロフィー系銅獲得ペプチドメタノバクチン(mb)10、11はCu(I)12に対する高い結合親和性のために治療可能性を示す。メチロシヌス・トリコスポリウムOB3bのメタノバクチン(mb-OB3b)がウィルソン病の動物モデルで研究された場合、銅は肝臓から効率的に除去され、胆汁13を通して排泄された。インビトロ実験では、mb-OB3bが肝臓サイトゾル13に含まれる銅メタロチオネインから銅をキレートできることを確認した。レーザーアブレーション誘導結合血漿質量分析イメージング技術は、ウィルソン病肝サンプル14、15、16における銅の空間分布を調査し、mb-OB3bであることを示した。わずか8日17の短い処理期間で銅を除去します。
mb-OB3bはまた、Ag(I)、Au(III)、Pb(II)、Mn(II)、Co(II)、Fe(II)、Ni(II)、およびZn(II)18、19を含む他の金属イオンと結合する。生理的Cu(I)結合部位に対する競争は、mb-OB3b複合体からCu(I)を置き換えることができるためAg(I)によって示され、Ag(I)およびNi(II)の両方もCu(I)19によって置き換えることができないMbへの不可逆的な結合を示す。近年、2His-2Cys結合モチーフを有する一連の代替メタノバクチン(amb)オリゴペプチドが20、21、及びそのZn(II)およびCu(I/II)結合特性を特徴とする。彼らの一次アミノ酸配列は類似しており、それらはすべて2His-2Cysモチーフ、Proおよびアセチル化N終産を含有する。2His-2Cysモチーフはmb-OB3bの2つのエネチオールオキサゾロン結合部位を置き換えるため、主にmb-OB3bとは異なります。
イオンモビリティ質量分析(ESI-IM-MS)と組み合わせたエレクトロスプレーイオン化は、質量電荷(m/z)と衝突を測定するため、ペプチドの金属結合特性を決定するための強力な計測器技術を提供します。断面(CCS)を使用しながら、溶液相から質量、電荷、立体形状を保存します。m/zおよびCCSは、ペプチオメトリー、プロトネーション状態、および立体構造形状に関連する。種に存在する各要素の同一性および数が明示的に同定されるため、ストイチオメトリーが決定される。ペプチド複合体の全体的な電荷は、酸性および塩基部位の原発状態および金属イオンの酸化状態に関する。CCSは、複合体の三次構造に関連する回転平均サイズを測定するので、ペプチド複合体の立体形状の情報を提供する。複合体の全体的な電荷状態はまた、pHの機能であり、カルボキシル、His、CysおよびTyrなどのデプロトン化された基本部位または酸性部位が金属イオンの潜在的な結合部位でもあるため、ペプチドの金属イオン結合親和性に影響を与える。分析のために、ペプチドおよび金属イオンは希希水性酢酸または水酸化アンモニウムによって調整されたpHと水溶液で調製される。これにより、pH依存性および金属イオン選択性がペプチドに対して決定され始める。さらに、ESI-IM-MSによって決定されたm/zおよびCCSをB3LYP/LanL2DZ分子モデリングと共に使用して、複合体の金属イオン協調および三次構造の種類を発見することができる。この記事に示す結果は、ESI-IM-MSが一連のアンブペプチドの選択的キレート性能を特徴付け、銅結合ペプチドmb-OB3bと比較する方法を明らかにする。
Protocol
Representative Results
Discussion
重要なステップ:ESI-IM-MSを介した検査のためのソリューションフェーズの動作の保存
ネイティブESIインストゥルメンタル設定は、ペプチオメトリー、電荷状態、および立体構造を保存するために使用する必要があります。ネイティブ条件の場合、コーン電圧、温度、ガスフローなどのESIソースの条件を最適化する必要があります。また、ソース、トラップ、イオンモビリティ、…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この資料は、1764436、NSF機器サポート(MRI-0821247)、ウェルチ財団(T-0014)、エネルギー省(TX-W-20090427-0004-50)およびL3コミュニケーションズの下で国立科学財団が支援する作業に基づいています。.私たちは、シグマプログラムを共有するためのカリフォルニア大学サンタバーバラのバウアーのグループに感謝し、ビデオで技術を実証するためのアヨバミ・イレサンミ。
Materials
| acetonitrile HPLC-grade | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A998SK-4 | |
| ammonium hydroxide (trace metal grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A512-P500 | |
| cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 255599-5G | |
| copper(II) chloride 99.999% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203149-10G | |
| copper(II) nitrate hydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 229636-5G | |
| designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides | Neo BioLab (neobiolab.com) | designed peptides were synthized by order | |
| designed amb5B,C,D,E,F peptides | PepmicCo (www.pepmic.com) | designed peptides were synthized by order | |
| Driftscope 2.1 software program | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
| Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b | cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce) | ||
| glacial acetic acid (Optima grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A465-250 | |
| Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 12357-09 | |
| lead(II) nitrate ACS grade | Avantor (www.avantormaterials.com) | 128545-50G | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203734-5G | |
| MassLynx 4.1 | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
| nickel chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203866-5G | |
| poly-DL-alanine | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | P9003-25MG | |
| silver nitrate 99.9%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 11414-06 | |
| Waters Synapt G1 HDMS | Waters (www.waters.com) | quadrupole – ion mobility- time-of-flight mass spectrometer | |
| zinc chloride anhydrous | Alfa Aesar (www.alfa.com) | A16281 |
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