Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi
Summary
Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.
Abstract
Dinamik protein-protein etkileşimleri, motiliteden DNA repliğine ve sinyal transdüksiyonuna kadar hücresel davranışı kontrol eder. Ancak, bir protein etkileşim ağında birden fazla protein arasındaki dinamik etkileşimleri izlemek teknik olarak zordur. Burada, Maruz Kalan Proteinlerin göreceli floresan ölçümlerine dayalı olarak protein etkileşimlerinde kat değişimlerinin kantitatif değerlendirmesini sağlayan Kantitatif Multipleks İmmünenyağış (QMI) için bir protokol sayılmiyoruz. Yüzey epitopleri (PiSCES). QMI’de, hücre lisatlarından gelen protein kompleksleri mikrokürelere immünpresipitat edilse ve pisces bolluğunu ölçmek için farklı bir protein için etiketli bir antikor ile incelenir. İmmünenen anatomikler farklı MagBead spektral bölgelere konjuge edilir, bu da bir akış sitometresinin birden fazla paralel immünoprepliti ayırt etmesini ve aynı anda her biriyle ilişkili prob antikor miktarını ölçmesini sağlar. QMI genetik etiketleme gerektirmez ve diğer immünopredipredityöntemleriile karşılaştırıldığında minimal biyomalzeme kullanılarak yapılabilir. QMI, etkileşim eden proteinlerin tanımlanmış herhangi bir grubu için uyarlanabilir ve şimdiye kadar T hücreleri ve nöronal glutamat sinapslarında sinyal ağlarını karakterize etmek için kullanılmıştır. Sonuçlar, potansiyel tanı ve tedavi uygulamaları ile yeni hipotez oluşumuna yol açmıştır. Bu protokol, ilk antikor paneli seçiminden çalışan tahlillere ve analiz verilerine kadar QMI’yi gerçekleştirmek için talimatlar içerir. Bir QMI tahlilinin ilk montajı, bir panel oluşturmak için antikorların taranmasını ve uygun bir lisis tamponunun ampirik olarak belirlenmesini içerir. Sonraki reaktif hazırlığı magbeadlar için kovalent kaplin immünopresian antikorlar içerir, ve bir streptavidin-konjuge florofile etiketlenmiş olabilir böylece biyotinilting prob antikorlar. Tofaş çalıştırmak için, lysate magbeads ile bir gecede karıştırılır, ve sonra boncuk bölünmüş ve farklı prob antikorları ile kuluçka, ve daha sonra bir florofor etiketi, ve akış sitometri tarafından okunur. PiSCES’i deneysel koşullar arasında önemli ölçüde farklılık gösteren iki istatistiksel test yapılır ve sonuçlar ısı haritaları veya düğüm kenarı diyagramları kullanılarak görselleştirilmiştir.
Introduction
Dinamik protein-protein etkileşimleri, çoğu hücresel fizyolojinin fonksiyonel temeli olan moleküler sinyalbasamaklarını ve hareketli yapıları oluşturur 1. Bu süreçler genellikle tek girişlere dayalı sabit durumlar arasında geçiş yapan doğrusal sinyal yolları olarak tasvir edilir, ancak deneysel ve modelleme verileri entegre ağlar olarak işlev ettiklerini açıkça göstermektedir2,3, 4. G proteinleri durumunda, farklı reseptörler genellikle aynı G proteinini aktive etme yeteneğine sahiptir ve tek bir reseptör de birden fazla G proteini türünü aktive edebilir5,6. Göreceli olarak az sayıda g protein sınıfının sinaptik iletim, hormon düzenlemesi ve hücre göçü gibi çok çeşitli hücresel fonksiyonları modüle edebilmesi için, hücrelerin bu sinyalleri hem entegre etmesi hem de farklılaştırmasıgerekir 4 , 5. Kanıtlar göstermiştir ki bu sinyal özgüllüğü, G proteinleri için yanı sıra diğerleri için, öncelikle ince ayarlı protein-protein etkileşimleri ve zamansal dinamikleri1temelinde türetilmiştir1 ,3, 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7. Sinyal ağları birden fazla giriş, çıkış ve geri besleme döngüleri ile dinamik protein kompleksleri oluşur çünkü, tek bir pertürbasyon bir hücrenin fizyolojisi4 genel homeostatik dengesini değiştirmek için fırsat vardır ,7. Şimdi yaygın olarak sinyalizasyon daha iyi anlamak için bir ağ perspektifinden incelenmesi gerektiğini kabul edilir nasıl birden fazla girdi entegrasyonu sağlık ve hastalık ayrık hücresel fonksiyonları kontrol eder7,8, 9,10,11,12,13. Bunun ışığında, dinamik protein etkileşim ağlarında kıvrım değişiklikleri hakkında orta-iş- ve nicel veriler toplamak için Kantitatif Multipleks İmmünopantüen (QMI) geliştirilmiştir.
QMI, hücre lisatının floresan boyaların farklı oranlarda bulunan manyetik boncuklarla kovalent olarak birleşen immünopresid antikorlarından oluşan bir panel ile kuluçkaya yatırıldığı antikor bazlı bir tahlilidir. Farklı manyetik boncuk sınıfları ile birleşen spesifik antikorların olması, aynı lysate’den birden fazla hedef proteinin eşzamanlı olarak ko-immünoprepitasyon almasına olanak sağlar. İmmünenyağış (IP) sonrasında manyetik boncuklar ikinci bir florofor konjuge prob antikor (veya florofor konjuge streptavidin ile birlikte biyotinylated antikor) ile kuluçkaya yatırılır. Her IP antikor-probu antikor çifti veya PiSCES (maruz kalan yüzey epitoprepleri tarafından saptanan ortak komplekslerde proteinler) tarafından tanınan proteinler arasındaki ortak ilişki, akış sitometrisi tarafından saptanır ve farklı örnek koşulları14. Şekil 1’deki çizimler, flüoresanslı konjuge prob antikorları ile etiketlenmiş immünopsipitated protein kompleksleri ile manyetik boncuk diyagramı da dahil olmak üzere, bir QMI testi nin çalıştırılmasında yer alan adımları göstermektedir (Şekil 1C).
QMI’nin duyarlılığı, immünopresipitasyon için kullanılan manyetik boncuk sayısına göre lysate protein konsantrasyonuna bağlıdır ve %10 kat değişikliklerini tespit etmek için bir çözüm elde etmek, diğer co-IP yöntemleri14,15. Örneğin, QMI’de kullanılan başlangıç materyalinin miktarı sandviç Enzime Bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) için gerekli olana benzer, ancak tek bir QMI testinde birden fazla etkileşim algılanır. 4 mm deri biyopsisinden izole edilmiş 1-5 x 105 primer T hücreleri, fare prefrontal korteksin 3 mm koronal bölümünden P2 sinaptozomal preparatlar veya 3 x 106 kültürlü fare primemi kullanılarak 20 IP ve 20 prob hedefi kullanılarak QMI tahlilleri yapılmıştır. kortikal nöronlar14,16,17. Bu duyarlılık QMI’yi klinik numuneler gibi sınırlı kullanılabilirlik teshisi olan hücrelerin veya dokunun analiziiçin yararlı hale getirir.
QMI daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağına uyarlanabilir (antikorların mevcut olması koşuluyla) ve bugüne kadar T hücre antijen reseptörü (TCR) sinyalozomve nöronlarda glutamaterjik sinapslarda protein alt kümesini analiz etmek için geliştirilmiştir. 17.000 , 18– T hücre reseptör sinyalizasyonu çalışmalarında, QMI ilk PiSCES stimülasyon kaynaklı değişiklikleri belirlemek için kullanılan ve daha sonra bir kontrol grubundan otoimmün hastaları ayırt etmek için, endojen otoimmün sinyal tespit ve son olarak oluşturmak için etkileşimlerin dengesiz bir hastalık ilişkili alt ağ içeren hipotez14. Daha yakın zamanda, aynı QMI paneli timosit seçimi tcr ilişkili protein sinyal19 nitel farklılıklar yerinenicel tarafından belirlenir belirlemek için kullanılmıştır. Nöronlarda, QMI sinaptik plastisite yeni ortaya çıkan modelleri destekleyen bir şekilde giriş sinyalleri farklı türleri için bir protein etkileşim ağının giriş-özel yeniden düzenlenmesi tanımlamak için kullanılmıştır17. Ayrıca, bu sinaptik QMI paneli otizm yedi fare modeli farklılıkları belirlemek için kullanılmıştır, kendi PiSCES biyoimzadayalı alt gruplar halinde modelleri küme, ve doğru daha önce tanınmamış bir paylaşılan moleküler açık hipotez modellerinden birinde16. Benzer bir yaklaşım, farklı uyuşturucu tedavilerine yanıt verebilecek diğer alt grupları taramak veya belirli duyarlı alt gruplara ilaç atamak için de kullanılabilir. QMI temel bilime ek olarak tanı, hasta alt yazma ve ilaç geliştirme potansiyel uygulamalara sahiptir.
QMI antikor paneli oluşturmak için, ilk antikor taraması ve seçim protokolleri Bölüm 1’de aşağıda açıklanmıştır. Antikor panelleri tanımlandıktan sonra, seçilen antikorların IP için manyetik boncuklara konjugasyonu ve seçilen prob antikorlarının biyotinylasyonu için protokoller Bölüm 2’de açıklanmıştır. Hücre veya doku lysates üzerinde QMI test çalıştırmak için protokol Bölüm 3 açıklanmıştır. Son olarak, tek bir deneme ~ 5 x 105 bireysel veri noktaları, talimatlar ve bilgisayar kodları veri işleme, analiz ve görselleştirme yardımcı üretebilir beri Bölüm 4 sağlanır. Bölüm 2-4’te açıklanan iş akışına genel bir bakış Şekil1’de gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
QMI tahlili antikor paneli geliştirme, ekipman ve reaktifler için önemli bir yatırım gerektirir, ancak tahkikat kurulduktan sonra, deneysel olarak kontrol edilen yanıt olarak protein etkileşim ağlarını gözlemleyerek yüksek boyutlu veri toplayabilir Uyaran. Teknik olarak, QMI dikkatli pipetleme ve örnek ve antikor kuyu yerleri izleme gerektirir. Tahlil plakalarının dikkatle etiketlenmesi, kağıt üzerindeki iyi konumların ayrıntılı bir şablonu nun yapılması gibi, daha sonra veri analizi için kayded…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar QMI tahlil geliştirme önemli katkıları için Tessa Davis kabul etmek istiyorum, ve teknik rehberlik ve entelektüel giriş için Smith ve Schrum laboratuvarları mevcut ve eski üyeleri. Bu çalışma NIMH hibe R01 MH113545 ve R00 MH 102244 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
Referências
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
- Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
- Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
- Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
- Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
- Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
- Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
- Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
- Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science’s STKE. 2007 (389), (2007).
- Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
- Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
- Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
- Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
- Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
- Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).
