Представлен протокол синтеза и измерения фотохимических свойств модульных соединений в клетке с помощью кликабельных муати.
Клетки соединений позволяют фото-опосредованные манипуляции физиологии клеток с высоким пространствентемспоральным разрешением. Тем не менее, ограниченное структурное разнообразие имеющихся в настоящее время кэш-групп и трудности в синтетической модификации без ущерба для их фотолиза эффективности являются препятствиями для расширения репертуара клетки соединений для живых клеток Приложений. Поскольку химическая модификация фото-кэширующих групп типа кумарин является перспективным подходом для подготовки клетчатых соединений с разнообразными физическими и химическими свойствами, мы сообщаем о методе синтеза кликабельных соединений, которые могут быть изменены легко с различными функциональными блоками через медь (I)-катализированная циклизация Huisgen. Молекула модульной платформы содержит (6-бромо-7-гидроксикумарин-4-ил) метил (Bhc) группу в качестве фото-группы, которая демонстрирует высокую эффективность фотолиза по сравнению с обычными 2-нитробензилами. Представлены общие процедуры приготовления кликабельных соединений, содержащих амины, спирты и карбоксилаты. Дополнительные свойства, такие как растворимость воды и способность таргетинга клеток, могут быть легко включены в кликабельные соединения в клетке. Кроме того, были измерены физические и фотохимические свойства, включая квантовый выход фотолиза, которые, как было установлено, превосходят соответствующие соединения ВХК. Поэтому описанный протокол можно рассматривать в качестве потенциального решения проблемы отсутствия структурного разнообразия в имеющихся соединениях, содеяненные в клетках.
Клетчатые соединения предназначены синтетические молекулы, первоначальные функции которых временно маскируются коваренными фото-съемными группами защиты. Интересно, что клетки соединений биологически значимых молекул обеспечивают незаменимый метод для пространственно-временного контроля клеточной физиологии1,2,3,4,5 ,6. В 1977 году Энгельс и Schlaeger сообщили 2-нитробензил эстер CAMP как мембраны проницаемой и фотолабильной производной cAMP7. В следующем году Каплан сообщил 1-(2-нитрофенил) этиловый эфир АТФ (NPE-ATP) и назвал это соединение “клеткой” АТФ8. С тех пор, ряд фотохимически съемных групп защиты, таких как 2-нитробензилы, р-гидроксифенациклы9, 2-(2-нитрофенил) этил10,11, 7-нитроиндолин-1-yls12 , 13, и (кумарин-4-ил) метилов14,15,16 были использованы для подготовки клеточных соединений.
Ожидается, что синтез соединений в клетке с желательными дополнительными свойствами, такими как проницаемость мембраны, растворимость воды и способность клеточного таргетинга, облегчат лечебное биологическое применение. Поскольку физические и фотохимические свойства этих молекул зависят в первую очередь от химической структуры фотохимически съемных защитных групп, используемых для их подготовки, требуется разнообразный репертуар фото-групп. Однако структурное разнообразие имеющихся в настоящее время кэш-групп, демонстрирующих высокую эффективность фотолиза, ограничено. Это может стать препятствием для увеличения использования соединений, налетемых в клетках.
Для решения этой проблемы репертуар фото-групп пополнился химической модификацией существующих фоторедвижутных защитных групп или дизайном новых фотолабильных хромофор с превосходными фотофизическими и фотохимическими свойствами. Примеры включают нитродибензоврана (NDBF)17, No 3-(4,5-диметокси-2-нитрофенил)-2-бутил” (DMNPB)18,19, кальций чувствительных 2-nitrobenzyl фотоклетка20, заменить coumarinylmethyls (DEAC45021 , DEAdcCM22, 7-азетидинил-4-метилкумарин23, и styryl coumarins24), цианина производных (CyEt-пан)25, и БОДИПИ производные26,27.
Кроме того, мы ранее разработали (6-бромо-7-гидроксикумарин-4-ил) метил (Bhc) группы и успешно синтезировали различные клетки соединений нейротрансмиттеров28, второй посланников29,30, и oligonucleotides31,32,33 выставке больших одно- и двухфотонных возбуждения поперечных сечений. Если дополнительные свойства могут быть легко установлены в кэш-группы без ущерба для их фоточувствительности, то репертуар клетчатых соединений может быть расширен34,35,36, 37,38,39. Поэтому мы разработали модульные соединения в клетке, которые состоят из трех частей, а именно группы Bhc в качестве фото-реакционный ядро, химические ручки для установки дополнительных функций, и молекулы, которые должны быть замаскированы40, 41.
Таким образом, данная статья предоставляет практический метод для подготовки клеточных соединений биологически значимых молекул. В настоящем протоколе описываются методы подготовки кликабельной платформы для фото-групп, внедрения дополнительных функций для расширения репертуара соединений в клетке, измерения их физических и фотохимических свойства, и клеточного типа селективного таргетинга кликабельного соединения клетки для дальнейшего применения клеток.
Ранее мы разработали Bhc клетке соединений различных биологически активных молекул, которые демонстрируют высокую фотолитической эффективности28,45,46,47. С целью расширения репертуара Bhc кэширования групп, мы также сообщили платформ модульных соединений клетке, которые могут быть легко изменены путем введения различных функциональных единиц32,40,41. Таким образом, настоящий протокол представляет собой метод синтеза кликабельного предшественника групп кэширования Bhc, которые могут быть изменены с помощью меди (I)-катализированной циклизации Huisgen. Синтез кликабельного предшественника, paBhcCH2OH (2), был достигнут с помощью четырехступенчатой последовательности реакции, начиная с коммерчески доступного 4-броморзорсинола(рисунок 1A). Преимущество настоящего протокола заключается в том, что не требуется никаких трудоемких шагов очистки (например, хроматографических сечения столбцов).
Как кликабельный предшественник paBhcCH2OH (2) может быть использован для маскировки различных функциональных групп, кликабельные клетки соединений аминов, спиртов и карбоксиловатых кислот были синтезированы с помощью 2 в качестве предшественника (Рисунок 1B). Амины были изменены как их carbamates в то время как спирты были изменены как их карбонаты. В общих процедурах 1 и 2 CDI использовался для приготовления кликабельных карбаматов, а для приготовления карбонат использовался 4-нитрофениловый хлоророформат. Как указывается в механизме реакции, оба реагента могут быть использованы для приготовления карбаматов и карбонат. Следует также отметить, что выход желаемого соединения в клетке зависит от химической структуры молекулы, которая будет в клетке. Другие примеры можно увидеть в наших предыдущих докладах28,30,33,48.
Нажмите модификация была выполнена с использованием небольшой модификации сообщили процедуры49. Добавление трис (триазолметил) амин основе лиганды необходимо для получения желаемых продуктов в хорошем к высоким урожаям. Поскольку различные азиды легко доступны как из коммерческих источников, так и из литературных процедур, мы можем подготовить различные модульные соединения клетке с дополнительными свойствами, такими как растворимость воды и клеточной способности ориентации (Рисунок 2).
Квантовый выход фотолиза затем измеряется в соответствии с процедурой28,50. На рисунке 3 показано, что фотолитическое потребление 2-glc-paBhcmoc-PTX и выпуск PTX были приближены к одноэкспоненциальному распаду и росту, соответственно, предполагая отсутствие внутренней фильтрации радиации или нежелательных вторичных эффектов. Улучшенный фотолиза квантовых урожаев() и фотолиза эффективности() были отмечены для кликабельных paBhc клетке соединений по сравнению с ранее сообщалось Bhc клетке соединений (Таблица 1)41, 43. Так как эффективность фотолиза() из Bhc клетке соединений более чем в сто раз выше, чем у 2-nitrobenzyl типа клетчатых соединений48, заметное улучшение в связи с наличием paBhc caging группы явно преимущество для этой системы.
В качестве доказательства концепции эксперимента, гидрофильные moiety был введен в 2 “-paBhcmoc-PTX (4) и клеточного таргетинга лиганд был введен в соединение 3 (Рисунок 2). Растворимость воды 2′-glc-paBhcmoc-PTX была в 650 раз выше, чем у материнского PTX(таблица 1). Селективная клеточная ориентация была достигнута с помощью системы тегов-зондов, и paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8)подшипник лиганд HaloTag был успешно направлен на клеточную мембрану культивированных клеток млекопитающих, выражающих белок синтеза HaloTag/EGFR ( Рисунок 4). Фото-опосредованный модуляции субклеточной локализации киназы также была достигнута с помощью кликабельного соединения клетки 5 (рисунок 5).
В заключение мы успешно продемонстрировали метод подготовки кликабельных платформ для фотоклеточных соединений биологически интересных молекул, которые могут быть легко модифицированы с дополнительными свойствами, такими как растворимость воды и клеточная ориентируясь на способность. Так как группа кэша paBhc может быть использована для подготовки любых молекул с изменяемыми функциональными группами, применение настоящего протокола не ограничивается молекулами, описанными в настоящем. Используя модульную платформу, а именно группу кэша paBhc, нужные соединения в клетке могут быть легко подготовлены, а их физические и химические свойства можно модулировать с помощью изменения кнопки.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI грант номер JP16H01282 (TF), Грант-в-помощь для научных исследований по инновационным областям “Память Динамизм”, и JP19H05778 (TF), “MolMovies”.
acetonitrile, EP | Nacalai | 00404-75 | |
acetonitrile, super dehydrated | FUJIFILM Wako | 010-22905 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
4-bromoresorcinol | TCI Chemicals | B0654 | |
N,N’-carbonyldiimidazole | FUJIFILM Wako | 034-10491 | |
chloroform | Kanto | 07278-71 | |
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9% | FUJIFILM Wako | 032-12511 | |
dichloromethane, dehydrated | Kanto | 11338-05 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) | TCI Chemicals | D0254 | |
4-dimethylaminopyridine | TCI Chemicals | D1450 | |
dimethylsulfoxide, dehydrated -super- | Kanto | 10380-05 | |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Sigma | D6046-500ML | |
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW | Olympus | ||
Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako | 054-07225 | |
Ethyl 4-Chloroacetoacetate | TCI Chemicals | C0911 | |
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red | FUJIFILM Wako | 087-08335 | |
hydrochloric acid | FUJIFILM Wako | 087-01076 | |
inverted fluorescent microscope IX-71 | Olympus | ||
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL | Biotage | 120-1906-D | |
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | FUJIFILM Wako | 196-01252 | |
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81 | Olympus | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | 11668027 | lipofection reagent |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Dojindo | 345-01804 | MOPS |
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC) | TCI Chemicals | C1400 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Thermo Fisher | 11058021 | reduced serum medium contains no phenol red |
1,10‐Phenanthroline Monohydrate | Nacalai | 26707-02 | |
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps | Rayonet | ||
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate | FUJIFILM Wako | W01SRM19-5000 | |
Sodium Acetate Trihydrate | Nacalai | 31115-05 | |
Sodium Bicarbonate | FUJIFILM Wako | 199-05985 | |
Sulfuric Acid, 96-98% | FUJIFILM Wako | 190-04675 | |
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | ALDRICH | 762342-100MG | |
tri‐Sodium Citrate Dihydrate | Nacalai | 31404-15 | |
Xenon light source, MAX-303 | Asahi Spectra |