Un método directo y simple para evaluar la viabilidad de Drosophila melanogasterde Embryo a Adult
Summary
Este protocolo está diseñado para evaluar la viabilidad de Drosophila en cada etapa del desarrollo, desde el embrión hasta el adulto. El método se puede utilizar para determinar y comparar la viabilidad de diferentes genotipos o condiciones de crecimiento.
Abstract
En Drosophila melanogaster, ensayos de viabilidad se utilizan para determinar la aptitud de ciertos orígenes genéticos. Las variaciones alélicas pueden resultar en la pérdida parcial o completa de viabilidad en diferentes etapas de desarrollo. Nuestro laboratorio ha desarrollado un método para evaluar la viabilidad en Drosophila de embrión a adulto completamente maduro. El método se basa en cuantificar el número de progenie presente en diferentes etapas durante el desarrollo, comenzando con embriones eclosionados. Una vez cuantificados los embriones, se cuentan etapas adicionales, incluyendo L1/L2, pupupas y adultos maduros. Una vez examinadas todas las etapas, se utiliza un análisis estadístico como la prueba de chi-cuadrado para determinar si existe una diferencia significativa entre el número inicial de progenie (embriones en cuba) y las etapas posteriores que culminan en el número observado de adultos, por lo tanto, rechazar o aceptar la hipótesis nula (que el número de embriones eclosionados será igual al número de larvas, pupupas y adultos registrados a lo largo de las etapas de desarrollo). La principal ventaja de este ensayo es su simplicidad y precisión, ya que no requiere un enjuague embrionario para transferirlos al vial de alimentos, evitando pérdidas por errores técnicos. Aunque el protocolo descrito aquí no examina directamente las larvas L2/L3, se pueden agregar pasos adicionales para tener las cuentas de estas. La comparación del número de embriones eclosionados, L1, pupas y adultos puede ayudar a determinar si la viabilidad se vio comprometida durante las etapas L2/L3 para estudios posteriores (el uso de alimentos de color ayuda con la identificación visual de larvas). En general, este método puede ayudar a los investigadores y educadores de Drosophila a determinar cuándo se ve comprometida la viabilidad durante el ciclo de vida de la mosca. La evaluación rutinaria de las poblaciones utilizando este ensayo puede prevenir la acumulación de mutaciones secundarias que pueden afectar el fenotipo del mutante originalmente aislado, especialmente si las mutaciones originales afectan la aptitud. Por esta razón, nuestro laboratorio mantiene múltiples copias de cada uno de nuestros alelos Dm ime4 y comprueba rutinariamente la pureza de cada stock con este método además de otros análisis moleculares.
Introduction
La vida útil se ve afectada por factores genéticos y no genéticos. En condiciones de crecimiento de laboratorio estándar a temperatura ambiente, nuestro laboratorio ha observado una variación significativa de la aptitud y la viabilidad entre los diferentes alelos Dm ime4 cultivados en condiciones idénticas (Figura1 y Figuras Suplementarias). Los estudios de viabilidad se realizan con frecuencia para investigar los efectos de una determinada combinación de alelo o condición de crecimiento en los estudios genéticos poblacionales1,2,3,4. Sin embargo, los análisis detallados de la viabilidad dentro de un grupo no complementario de mutaciones son difíciles de encontrar en la literatura científica. Un alelo suele estar etiquetado como “no esencial” si el investigador encuentra a unos pocos individuos homocigotos para ese alelo dentro del vial de alimentos que alberga el stock equilibrado5,6. Sin embargo, los análisis precisos de Chi-cuadrado para evaluar si estos homocigotos surgen en las proporciones mendelianas esperadas no se notifican5,6. La temperatura más permisiva para cualquier población de Drosophila es la temperatura ambiente (22-23 oC) y, conlos nutrientes adecuados, el ciclo de vida de las moscas de tipo salvaje tarda aproximadamente doce días en completar 7,8. Como la duración de cada etapa de desarrollo de Drosophila de tipo salvaje se conoce7,8, el método descrito en este informe se puede utilizar para examinar si la cepa drosophila en estudio es adecuada en cada etapa en comparación con un control apropiado para los antecedentes genéticos probados. A diferencia de los estudios que se centran en un aspecto específico del desarrollo9, este protocolo proporciona una forma práctica de evaluar la viabilidad en diferentes etapas del desarrollo.
En nuestro laboratorio, este protocolo se utiliza para evaluar la viabilidad de las existencias que son deficientes para Drosophila Inducer de Meiosis 4 (Dm ime4). Dm ime4 es un gen esencial10 que codifica un ARN metiltransferasa con funciones críticas en el metabolismo del ARN en Drosophila y otros organismos multicelulares5,6,10, 11 , 12 , 13 , 14 . Para evaluar rápidamente los alelos novedosos de Dm ime4 generados a través de CRISPR/Cas9 (FigurasSuplementarias),se realizó un ensayo de viabilidad de punto final que sólo contaba la progenie adulta producida dentro de viales de existencias equilibradas (Figura1). Algunas de las acciones utilizadas se describen en informes anteriores de Dm ime4 5,6. Los mutantes homocigotos surgieron a niveles sub-mendelianos, según lo determinado por los análisis de chi-cuadrado (Figura1 y Materiales Suplementarios). Para evaluar si estas cifras inferiores a lo esperado se debieron a menos embriones, o menos embriones eclosionados, o a la pérdida de viabilidad en L1/L2 o pupupae, ampliamos el seguimiento para incluir recuentos en cada una de estas etapas del desarrollo (Figura2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8y Figura 9).
Aquí, describimos el método usando moscas de tipo salvaje (OreR). Para probar empíricamente este método para su uso con otros orígenes genéticos o especies de Drosophila, recomendamos utilizar OreR como referencia y ajustar los puntos de tiempo según el organismo experimental. El protocolo se evaluó además para evaluar la viabilidad de la progenie generada cruzando hembras vírgenes de tipo salvaje con machos de una reserva mutante heterocigoto Dm ime4 5,6 (Figura4).
Protocol
Representative Results
Discussion
En resumen, este método proporciona una evaluación precisa y sencilla de la viabilidad en Drosophila. Todo el protocolo tarda aproximadamente 14 días en completarse. El procedimiento no requiere habilidades técnicas expertas; sin embargo, el momento adecuado, un cronograma de observaciones diarias y una transferencia cuidadosa de agar es importante para la precisión y reproducibilidad.
Además de la colocación del embrio del disco de uva-agar en el vial de alimentos, otro paso crucial en el procedimiento es transferir el disco de agar a un vial de alimentos a más tardar 48 horas después de retirar la placa de agar de uva de las mini jaulas de colección de embriones. La transferencia del agar después de 48 h dio lugar a la pérdida de embriones y larvas, probablemente debido a la deshidratación del disco de agar. Para contar las transiciones L2/L3, la placa necesita incubar durante 72 h. Si esta etapa es crucial, las placas de agar de uva deben ser vertidas más gruesas y se debe utilizar una cámara húmeda para evitar la desecación. Las cruces se instalaron en jaulas de recogida de embriones que acomodan placas de 35 mm; sin embargo, este procedimiento también se puede realizar utilizando jaulas de recolección de embriones más grandes, como una que acomoda placas Petri de 60 mm o 100 mm. Las botellas de comida deben ser lo suficientemente grandes como para acomodar esos tamaños.
Hay pasos que se pueden agregar a este protocolo. Como se mencionó anteriormente, las transiciones L2/L3 son difíciles de cuantificar en las placas debido al tiempo requerido y a la posible deshidratación del agar. Además, las larvas se vuelven altamente móviles en la superficie del agar, lo que plantea un desafío para contarlas con precisión. Colocar las placas en el refrigerador durante 30 minutos o añadir unas gotas de un anestésico suave (solución de lidocaína) en la superficie del agar antes de contar las larvas L2/L3 puede ayudar a ralentizar sus movimientos para contarlas con mayor precisión. Una advertencia a estas modificaciones es que pueden introducir variables (sensibilidad fría, sensibilidad anestésica) y confundir los resultados de viabilidad. Incluso sin estos pasos, mediante el uso de alimentos de colores, los investigadores pueden cuantificar L3s itinerante/prepupae a medida que se asientan en el lado de los viales de alimentos para iniciar la pupación. Una limitación a este método es que requiere que los adultos utilizados en las cruces sobrevivan siendo anestesiados con CO2 para el fenotipado para configurar las cruces en las jaulas de recolección de embriones. Los machos mutantes homocigotos Dm ime4 no se recuperan bien y mueren unas horas después de despertarse del tratamiento con CO2. Se pueden explorar otros métodos para inmovilizar a los adultos para la clasificación, como colocar viales en el refrigerador durante unos minutos y luego transferir viales al hielo triturado para ralentizar el movimiento y ordenar de forma rápida y eficiente.
Además de comparar las fortalezas alélicas y sus efectos sobre la viabilidad, este método se puede utilizar para la sensibilidad de la pantalla o la resistencia a compuestos farmacéuticos definidos. A diferencia de otros métodos que examinan la toxicidad compuesta en el cultivo celular15,16,17,18, este método utiliza organismos enteros, haciendo la evaluación de los efectos del desarrollo más fácil de analizar. En resumen, utilizando este protocolo y modificaciones en el mismo, permitirá medir las fortalezas alélicas, así como los efectos de factores ambientales y compuestos químicos en la viabilidad de Drosophila, la fecundidad, la fertilidad, la vida útil y la duración de desarrollo.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nuestro trabajo está financiado por NIH 1R15GM1131-01 a CFH y NIH PA -12-149 A CFH.
Materials
| Antimold additive | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
| Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
| CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
| Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
| Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
| Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
| Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
| Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
| Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
| Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
| Metal spatula (small) | Carolina | ||
| Microwave | Any | To cook grape agar | |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
| Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |
Referências
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