디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

주의: 여기에 설명된 프로토콜에는 유해 화학물질, 날카로운 물체, 전기 장치, 뜨거운 물체 및 부상을 초래할 수 있는 기타 위험 요소의 사용이 포함됩니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 하며 안전 교육을 포함한 적절한 안전 절차를 따라야 합니다. 1. 재료 및 솔루션 준비 30분 동안 리소제니 국물 배지(LB)를 준비하고 오토클레이브: 중간 크기 1L당 트립톤 10g, 세균 효모 추출물 5g, NaCl 10 g을 섞고 탈이온화(DI) 물 1L에 녹입니다. 1 L 공동 발현 배양물의 경우, 30 분 동안 2.8 L Erlenmeyer 플라스크 믹스 12 g, 박테리아 효모 추출물 24 g, 10 % (v / v) 글리세롤 40 mL를 준비하고 860 mL의 DI 물에 용해하십시오. 10x 인산완충액1.3L[DI물 1.3L, 모노포타시움 인산염 30.03 g(KH2 PO4),및 163.02 g의 디포타슘 인산염(K2 HPO4)]을준비하고 상기 배지에 첨가한다. 카타볼라이트 억압(SOC) 매체로 슈퍼 최적 국물을 준비하세요. 2% (w/v) 트립톤, 0.5% (w/v) 세균 효모 추출물, 8.5 mM NaCl 및 2.5 mM KCl을 함유한 용액을 30분 동안 준비하고 오토클레이브합니다. 멸균 MgSO4와 포도당을 최종 농도 20 mM으로 추가하십시오. pH 7.0으로 조정하려면 1M NaOH를 사용합니다. SOC 용지를 -20°C에 보관하십시오. 피루베이트 1M 나트륨 1L을 준비합니다. 오토클레이브를 15분 동안 4°C에서 보관하십시오. 멸균 DI 물에서 1 M 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 20 mL를 준비합니다. -20 °C에서 1-2 mL 알리쿼트 보관하십시오. 침투 버퍼를 준비: 10 mM MES (1.952 g) 및 10 mM MgCl2 (2.033 g) DI 물 1 L에 용해. 4 °C에서 보관하십시오. 30 분 동안 LB 한천을 준비하고 오토 클레이브하십시오 : DI 물 100 mL 당 트립톤 1 g, 박테리아 효모 추출물 0.5 g, NaCl 1 g 및 한천 1.5 g을 추가하십시오. LB 한천이 병을 다룰 수 있을 만큼 차가워지면 원하는 플라스미드 조합에 필요한 항생제를 추가하십시오. 페트리 접시를 사용하여 한천 접시를 붓고 4 °C에서 보관하십시오. 대장균 및 N. 벤타미아나의화합물 생산에 관한 사양은 표 1을 참조하십시오. 리팜피신을 함유한 플레이트를 호일에 싸서 보관 시 열화를 방지합니다. 작업 농도(μg/mL) 항생제 재고(mg/mL) 용 매 플라스미드 1개 플라스미드 2개 플라스미드 3개 또는 4개 카르베니실린 50 H2O 50 25 20 클로람페니콜 30 에토 (동부)는 30 20 20 카나마이신 50 H2O 50 25 20 스펙티노마이신 30 H2O 30 25 20 겐타마이신 50 H2O 30 리팜피신 10 메오 (주) 10 표 1: 대장균 또는 N. 벤타미아나에서플라스미드 공동 발현을 위한 항생제 농도. 2. 대장균에서 디테르페노이드 대사 산물 의 생산 참고: 대장균에서 디테르페노이드 대사 산물을 생산하기 위해 여기에 설명된 프로토콜은 르우벤 J. 피터스 박사(아이오와 주립 대학, IA, 미국)의 그룹이 개발한 이전에 보고된 효소 공동 발현 플랫폼에서 채택되었습니다13 ,32. 플라스미드 조합으로 유능한 세포의 변형. 얼음 상에서 화학적으로 유능한 대장균 세포를 해동하였다(BL21DE3-C41 세포는 이 프로토콜에서 사용되었다). 1.5 mL 마이크로튜브에서 유능한 세포의 25 μL에 공동 발현에 사용되는 각 구제의 100 ng/μL 용액 1 μL을 추가합니다. 파이펫팅하여 소용돌이나 섞지 마십시오.참고: TPS 및 P450 효소의 최적의 발현 및 활성을 위해서는 여러 서열 변형을 고려해야 합니다. TPS의 경우, N-말단 석고 통과 펩티드의 제거는 종종 필수적이다. 구체적으로, 석고 모노-및 디-TPS는 전형적으로 예측된 통과 펩티드(일반적인 예측 알고리즘37사용)의제거를 요구하는 반면, 세포질 sesqui-TPS는 일반적으로 전체 길이 유전자로서 사용될 수 있다. P450s에 관해서는, N-말단 트랜스멤브레인 도메인의 리더 서열 MAKKTSSKGK를 제거 또는 교체할 뿐만 아니라 코돈 최적화는 많은 경우에38,39에서효과가 입증되었습니다. 또한, P450 효소를 공동 발현할 때 충분한 P450 활성을 보장하기 위해 시토크롬 P450 환원효소(CPR)를 포함시켜야 한다. 혼합물을 30분 동안 얼음 위에 배양합니다. 37°C에서 SOC 매질 및 LB 한천 플레이트를 원하는 구성물의 조합에 필요한 항생제를 함유한다.참고: 공동 변형될 각 구성은 최적의 단백질 발현을 보장하기 위해 뚜렷한 항생제 내성뿐만 아니라 복제의 뚜렷한 기원을 가져야 합니다. 세포 혼합물을 42°C에서 1분간 가열한 다음, 얼음위에 2분 이상 배양한다. 따뜻한 SOC 용지 200 μL을 추가합니다. 37°C 및 200 rpm에서 1시간 동안 세포 혼합물을 흔들어 줍니다. 따뜻하게 데운 LB 한천 접시에 약 10개의 오토클레이브 유리 구슬을 넣습니다. 셀 혼합물의 100 μL을 넣고 뚜껑을 교체합니다. 뚜껑을 닫고 접시를 수평으로 흔들어 세포를 고르게 분배합니다. 유리 구슬을 폐기물 용기에 두드려 제거합니다. 대안적으로, 다른 바람직한 도금 방법을 사용한다. LB 한천 플레이트를 37°C에서 밤새 배양하고 코팅된 표면을 아래로 향하게 합니다. 형질전환된 대장균 콜로니를 가진 플레이트는 다음날 사용하거나 파라핀 필름에 밀봉하여 최대 2주 동안 4°C에 보관할 수 있다. 접종 문화의 준비 다음 날, 표 1에제공된 농도를 이용하여 형질전환플라스미드 조합에 필요한 항생제를 사용한 LB 배지의 용액을 준비한다. 멸균 후드에서 LB 배지 5mL를 플라스틱 통기성 캡이 있는 15mL 멸균 유리 시험관으로 옮김. 원하는 큰(1L) 배양에 대해 하나의 작은 배양 튜브를 준비한다. 파이펫 팁을 사용하여 LB 한천 플레이트에서 개별 대장균 콜로니를 선택합니다. 선택된 콜로니를 포함하는 하나의 피펫 팁을 각 튜브에 배출하여 대장균 콜로니로 LB의 각 튜브를 접종합니다. 통기성 플라스틱 캡각 접종 배양 시험관을 캡. 뚜껑을 덮은 대장균을 37°C 의 증식 인큐베이터에 12-24시간 동안 놓는다. 공동 표현 문화의 준비 및 유도 다음 날, 1x의 최종 인산 완충 농도에 대해 제조된 결핵의 900 mL에 제조된 10x 인산완충액의 100 mL를 추가한다. 표 1에따라 농도로 필요한 항생제를 추가합니다. 37°C에서 140rpm에서 따뜻해지며(약 30분) 흔들어 주세요. 접종 배양액의 5 mL로 1 L 배양에 대한 각 배지 플라스크를 접종합니다. 접종 배양 튜브에서 접종 배양에 사용되는 파이펫 팁을 유지하여 후속 단계에서 유기 용매로 추출할 때 추출 된 플라스틱 오염 물질이 없도록하십시오. 600 nm (OD 600)에서 광학 밀도가 0.6, 약 3 h에 도달 할 때까지 200 rpm에서 흔들림으로 배양하십시오. 분광광도계로 OD600을 측정하려면 인산완충액과 멸균 TB를 블랭크로 사용합니다. 원하는 OD600에서인큐베이터 설정을 16°C로 설정합니다. P450s를 공동 발현할 때, 충분한 P450 공동 인자 생산에 필수적인 리보플라빈과 아미노레불린산을 신선하게 준비하십시오. 모든 실험에 대해 4 g/L 리보플라빈과 150 g/L 아미노레불린산을 만드세요. 리보플라빈은 가볍기 때문에 사용 될 때까지 호일에 싸서 보관하십시오. 인큐베이터가 16°C(약 30분)에 도달한 후, 1 mL의 1 mL, 4 g/L 리보플라빈1 mL, 각 배양액에 1mL, 1mL의 아미노레불린산을 추가합니다. 디테르페노이드 생산을 위해, 충분한 전구체 형성을 보장하기 위해 각 배양에 25 mL의 1 M 나트륨 피루브를 첨가해야합니다.참고: 이 분석법에 사용된 모든 구문은 동일한 IPTG 유도 프로모터 하에 있었다. 상이한 프로모터는 원하는 대로 사용될 수 있다. 16 °C에서 배양 하고 72 시간 동안 140 rpm. 디테르페노이드를 생산하는 경우 유도 후 매일 25 mL의 나트륨 피루브를 추가하십시오. 즉시 사용 배양은 대사 산물의 분리 깔때기 추출에 즉시 사용된다; 문화를 수확하거나 저장하지 마십시오. 3. 대사 산물의 분리 및 정제 대사 산물의 분리 깔때기 추출참고: 가소제 오염을 방지하기 위해 유기 용매를 사용할 때는 유리 제품및 유리 파이펫만 사용하는 것이 중요합니다. 연기 후드에서 분리 깔때기를 링 스탠드에 고정하십시오. 분리 깔때기 아래에 폐기물 비커를 놓습니다. 50/50(v/v) 에틸 아세테이트/헥산을 분리 깔때기에 500 mL를 붓습니다.참고: 용매 혼합물은 표적 대사 산물의 용해도 및 극성에 따라 조정되어야 합니다. 적절한 상 분리를 보장하기 위해 수분 용매를 피해야 합니다. 대장균 배양500 mL을 분리깔때기에 넣고 유리 마개 위에 놓습니다. 유입경로를 흔들어 배양액을 추출 용매와 약 5-10배 섞는다. 깔때기를 거꾸로 잡고 압력을 방출하기 위해 연기 후드를 가리키는 동안 스피고를 열어 깔때기를 자주 가스를 분리합니다. 흔들림 및 탈가스 절차를 2x 반복합니다. 깔때기를 링 스탠드에 똑바로 놓고 용매 층(상단)이 수성(culture) 층(아래)에서 분리될 때까지 약 1분 정도 기다립니다.참고: 상 간에서 다량의 기포가 관찰되면 5-10 mL EtOH의 소량을 첨가하여 상 분리를 개선할 수 있습니다. 스토퍼를 분리합니다. 대장균 층을 폐비커에 빼내고 깔때기의 용매 층을 유지합니다. 대장균 배양물의 나머지 500 mL및 제1 추출에 사용된 동일한 500 mL 용매를 사용하여 절차를 반복한다. 추출된 대사 산물을 함유한 용매를 깨끗한 플라스크에 빼낸다. 대장균 배양으로 오염을 피하십시오. 회전 증발 농도 회전 증발 (rotovap) 장비를 준비 : 수조를 채우고 25 ° C로 온도를 설정합니다. 열에 민감한 화합물의 경우, 낮은 온도 설정을 사용하거나 수조에 얼음을 추가하십시오. 응축 챔버를 드라이 아이스로 채우고 회전 속도를 60-80rpm으로 설정합니다. 추출된 대사 산물 약 700 mL을 1 L 증발 플라스크에 넣고 로토바프에 부착한 다음 수조에 더 낮춥니다. 수조 히터를 켜고 25°C로 설정합니다. 증발 플라스크의 회전을 시작하고 진공 시스템을 켜고 점차적으로 흡입을 증가하여 대사 산물 용액이 폐 플라스크에 급속히 끓는 것을 피하십시오. 증발 된 용매는 응축 및 응축수 수집 (폐기물) 플라스크로 떨어지는 것을 시작해야합니다. 대사 산물 용액의 몇 mL만 증발 플라스크에 남아 있을 때, 회전을 중지하고 진공 시스템을 끕니다. 증발 플라스크를 올리고 진공 라인을 닫아 감압합니다. 증발 플라스크에 남아있는 농축 대사 산물 용액을 유지하십시오. 폐기물을 폐플라스크에 폐기하십시오. 증발 플라스크에 최대 700 mL의 추출된 대사 산물 용액을 추가하여 회전 증발을 계속합니다. 추출된 모든 대사 산물 용액이 농축될 때까지 과정을 반복합니다. 유리 피펫을 새 시험관으로 옮겨 증발 플라스크에서 농축된 대사 산물을 제거합니다. 50/50(v/v) 에틸 아세테이트/헥산 또는 원하는 용매 혼합물을 5mL로 증발 플라스크를 헹구고 헹구어 헹구어 헹구어 헹구십시오. 농축 대사 산물을 -20 °C 또는 -80 °C (제품 안정성에 따라 다름)에서 추가 로 사용할 때까지 보관하십시오. 실리카 기둥 정화 1L 비커, 유리 깔때기, 50 mL 시험관 및 3.2 L 크로마토그래피 컬럼(유리 프렛 장착)을 헥산으로 한 번, 에틸 아세테이트로 한 번 헹구어 유리 제품을 준비합니다. 분수를 수집하는 데 사용되는 50 mL 시험 튜브에 라벨을 지정합니다. 실리카 겔 2L(230-400 메쉬, 60등급)을 2L 의 저수지 용량과 프릿디스크가 있는 3.2L 크로마토그래피 컬럼에 추가한 다음, 모래를 적재하여 기둥 상단에 5cm 층을 형성합니다. 헥산 2 L로 철저히 플러시하여 크로마토그래피를 위한 컬럼을 준비합니다. 항상 컬럼이 건조하지 않거나 에어 포켓을 획득하지 않도록 컬럼의 모래 층 위에 용매 액체의 얇은 층 (~ 0.5 cm)이 있어야합니다. 에어 호스에 연결된 유리 입구 어댑터를 사용하여 중력만이 아닌 컬럼을 통해 유량을 부드럽게 늘릴 수 있습니다. 농축된 대사산물 추출물(섹션 3.2 참조)을 컬럼에 로드합니다. 샘플을 3x로 들어 있는 병을 헥산으로 헹다닌 다음 컬럼에 추가하여 모든 샘플이 옮겨졌는지 확인합니다. 다음 그라데이션을 사용하여, 한 번에 100 mL을 로드하고 표지 된 시험 튜브에서 50 mL 분획을 수집 : 100 % 헥산 3 x, 헥산 3 x에서 10 % (v / v) 에틸 아세테이트, 헥사네스 3 x에서 12.5 % (v / v) 에틸 아세테이트 3 x, 15 % (v / v) 아세산 , 헥산3배의 에틸 아세테이트 20% (v/v) 헥산에 40% (v/v) 에틸 아세테이트 3배, 헥산3x의 에틸 아세테이트 60% (v/v) 에틸 아세테이트, 100% 에틸 아세테이트 4x.참고: 그라데이션은 복합 크기와 극성 및 원하는 분리에 따라 조정되어야 합니다. 유리 파이펫을 사용하여 각 분획에서 1 mL을 표지된 GC 바이알로 옮김을 전달합니다. GC-MS를 통해 각 샘플을 분석하여 원하는 대사 산물과 순도 수준을 포함하는 분획을 결정합니다.참고: 이 방법에서 생성된 대사산물에 적합한 GC-MS 방법은 Mafu 등 201839에기재되어 있다. 간단히 말해서, 모든 분석은 HP-5MS 컬럼(재료 표참조),시료 부피 1 μL, 오븐 온도 램프를 50°C에서 300°C에서 20°C분 -1로사용하여 XL MS 검출기를 사용하여 GC에서 수행하였다. 관심 있는 화합물을 포함하는 분수를 결정한 후 동일한 화합물을 포함하는 모든 분수를 결합합니다. 화합물을 포함하지 않는 분획을 폐기물 용기에 적절하게 폐기하십시오. 정제 된 대사 산물을 집중시키기 위해 필요한 경우 회전 증발 절차를 반복하십시오. 추가 정제가 필요한 경우, 제품 순도를 개선하기 위해 (반)예비 HPLC를 사용하십시오. HPLC 프로토콜은 개별 장비 사양 및 관심 화합물에 따라 조정되어야 합니다. 1 mL 헥산 (디테르펜 탄화수소) 또는 아세토니트릴 (산소 디터 페노이드)에서 말린 실리카 크로마토그래피 샘플을 다시 중단하고 필터 주사기를 통해 필터를 통해 작은 입자로오염을 방지합니다. 비극성 디터페노이드의 경우 권장 유속이 1mL/min인 CN 열(재료 표참조)과 헥산:에틸 아세테이트 그라데이션을 사용하여 분수가 1분마다 수집됩니다. 극성 디터페노이드의 경우 권장 유속이 3mL/min인 C18 열(재료 표참조)과 아세토니트릴:물 그라데이션을 사용하여 분수가 1분마다 수집됩니다. 모든 HPLC 정제 분획을 질소 스트림 하에서 건조시키고 GC-MS 분석 전에 1 mL 헥산에서 재중단하여 제품의 풍부성과 순도를 평가합니다. 4. N. 벤타미아나를 이용한 디테르페노이드 대사산물 생산 참고 : N. benthamiana에서 디테르페노이드 대사 산물을 생산하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 이전에보고 된 연구35,36,40,41에서적응되었습니다. 아래 프로토콜은 N. 벤타미아나 잎의 주사기 침투에 특정합니다. 진공 침윤과 같은 다른 침투 방법은 동일하게 적합합니다. pCAMBIA130035Su (pLIFE33) 또는 pEAQ-HT40,41,42,대장균 및 A. tumefaciens 및 식물 숙주에서 유전자 발현을 가능하게하는 이진 T-DNA 벡터 시스템은 이 프로토콜에 적합합니다. 니코티아나 벤타미아나 심기 750 mL 냄비 한 개를 화분에 채우고 냄비에 물을 주면 됩니다. ~ 20 담배 씨앗을 추가하고 부드럽게 그들이 토양에 있도록 손가락으로 두드려. 토양으로 덮지 마십시오.참고 : 씨앗은 종자 번식을위한 자체 수분을 통해 생성 될 수있다. 이 실험에 대 한 씨앗 식물 생물학의 UC 데이비스 학과에서 얻은, USDA 세균 저장소를 통해 공개적으로 사용할 수 (https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450). 토양이 건조하지 않도록 격일로 물을 다음과 같은 조건으로 성장 챔버에 냄비를 둡니다. 이 프로토콜의 모든 단계에 대해 16:8 h:night 사이클로 26°C 및 60% 습도에서 식물을 재배합니다. 1 주 후, 포팅 토양으로 ~ 20 냄비를 채우고 냄비에 물을. 집게를 사용하여, 줄기에 의해 담배 모종을 잡고 부드럽게 소스 냄비에서 제거, 각각의 새로운 냄비에 하나의 모종을 배치하고 조심스럽게 뿌리를 파고. 잎이나 뿌리를 손상시키지 마십시오. 냄비에 있는 트레이에 물을 놓아 격일로 식물에 물을 주세요(“바닥 급수”라고도 함). 매 4 급수는 패키지 지침에 따라 물에 일반 비료를 포함합니다. 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101 유능한 세포의 동결 해동 형질전환 해동 아그로박테리움 tumefaciens 변형 GV3101 (또는 다른 바람직한 변형) 얼음에 유능한 세포 (~ 1 시간). 얼음에 0.2 mL 미세 원심 분리튜브를 미리 냉각시. 28 °C에서 따뜻한 SOC 매체. 피펫 팁(위아래 피펫을 피펫하지 않음)과 차가운 1.5 mL 마이크로튜브로 각 변형을 위해 15 μL의 셀을 부드럽게 혼합합니다. 유능한 세포의 각 튜브에 DNA 1-5 μL (~400 ng)을 추가하고 튜브 랙을 따라 튜브를 긁어 부드럽게 섞습니다.참고 : 원하는 구조는 각각 별도로 변형되고 침투하기 전에 혼합되기 때문에 다른 항생제 내성을 가질 필요가 없습니다. 마이크로튜브를 액체 질소에 5분 동안 놓습니다. 액체 질소에서 마이크로튜브를 제거하고 튜브를 실내 온도 랙에 놓습니다. 37°C 인큐베이터에서 5분 동안 튜브를 해동합니다. 각 마이크로튜브에 미리 온난(28°C) SOC의 250 μL을 추가합니다. 28-30 °C, 225 rpm에서 3 시간 동안 흔들어 주세요. 플레이트 50 μL은 2.1.8단계에서 기재한 바와 같이 멸균 유리 비드를 사용하여 표 1에 기재된 필요한 항생제를 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 변형된 세포를 상으로 한다. 인큐베이트 플레이트는 48시간 동안 28-30°C에서 반전되어배양1일 이내에 성장하여 오염의 징후일 수 있다. 형질전환된 A. 투미파시엔은 2일 배양 후 사용하거나 파라핀 필름에 밀봉하여 최대 2주 동안 4°C에서 보관할 수 있다. 아그로박테리움 -니코티아나 벤타미아나에서 중재된 과도 효소 공동 발현 자두 4 주 된 니코티아나 벤타미아나 식물 2 일 전에 낮은 잎을 제거하여 침투합니다. 4 개의 상단 잎을 둡니다. 식물에 물을. 오픈 스토마타와 쉽게 침투할 수 있도록 침투하기 전에 식물에 24 시간 물을 하지 마십시오. 선택한 구성부 및 아그로박테리움 균주에 적합한 항생제의 작업 농도로 LB 10 mL을 호일 뚜껑이 있는 50 mL 멸균 유리 시험관에 추가합니다. 파이펫 팁을 사용하여 변형된 아그로박테리움의 단일 콜로니를 면봉하고 팁을 LB 용지로 배출합니다. 각 아그로박테리움 형질전환제에는 적어도 2개의 작은 배양이 있어야 한다. 28 °C 및 220 rpm에서 밤새 배양합니다. 분광광도계를 사용하여 야간 배양물의 600 nm(OD600)에서광학 밀도를 측정합니다. 하룻밤 배양액을 OD600 의 1로 희석한다.참고: 최적의 OD600 값은 다른 아그로박테리움 균주를 사용할 때 다를 수 있습니다. 희석된 하룻밤 배양물 10 mL을 50 mL 원엽 튜브에 분배합니다. 3500 rpm에서 원심분리로 박테리아를 15 분 동안 방 온도에서 수확하십시오. 부어 서상한 것을 버리십시오. 튜브를 부드럽게 흔들고 튜브 랙에서 압연하여 10 mL 침투 버퍼에서 배양을 다시 중단합니다. OD600은 각 구문에 대해 1과 같아야 합니다. 각 형질전환된 세포주의 동일한 부피를 결합하여 침투에 필요한 조합을 생성합니다. OD600은 각 침투에 대해 1과 같아야 합니다. 잎 당 5 mL의 침투 용액, 식물 당 2 잎을 추정합니다. 튜브를 로커에 수평으로 부착하고 실온에서 2시간 동안 부드럽게 바위를 바위. N. 벤타미아나 식물당 약 5 mL의 침윤 혼합물을 사용하여 N. 벤타미아나 식물당 ~2 잎을 침투시다. 잎 의 밑면에 바늘없는 주사기로 건강한 잎에 침투하고 잎의 상단에 손가락으로 반대 압력을 가하여 침투 용액이 잎 조직을 가득 채우도록합니다. 모든 침투된 잎을 검은색 마커 또는 기타 표시기로 표시합니다. 5 일 동안 성장 챔버에 침투 한 식물을 배치하십시오. 식물에 물을 잘 유지하십시오.참고: 5일간의 인큐베이션 시간은 제품 형성시간 효율을 유지하면서 대부분의 다운스트림 분석에 충분한 디테르페노이드 수준에 도달하기에 충분한 것으로 입증되었습니다. 더 긴 잠복기는 더 높은 제품 양이 요구되는 경우에 시험될 수 있습니다. 변형된 니코티아나 벤타미아나에서 대사산물 추출 및 정제 식물에서 잎을 잘라서 수확합니다. ~ 100 mL의 액체 질소와 단일 잎을 박격포에 넣고 미세한 분말을 얻을 때까지 박격포와 유봉 또는 조직 밀을 사용하여 분쇄합니다. 가루 조직을 GC-MS 바이알에 500 μL 경계에 첨가한다. 1.5 mL의 50/50 (v/v) 에틸 아세테이트/헥산 또는 원하는 용매 혼합물을 바이알과 캡에 단단히 넣습니다. 원하는 제품을 제공하기 위해 시험된 발현의 경우, 지상 조직을 더 큰 플라스크 또는 시험관으로 풀한 다음, 조직 부피보다 ~2배의 용매량을 추가하고 밤새 흔들어 줍니다. 정화를 위해 4.4.5 단계로 진행하십시오. 모든 바이알을 마이크로튜브 랙에 놓고 테이프를 단단히 내려놓아 단단히 고정하십시오. 실온에서 밤새 격렬한 흔들림으로 추출하십시오. 400 μL의 추출물과 600 μL의 헥산을 신선한 GC-MS 바이알에 옮김. 잎 조직을 알리인용하지 마십시오. 3.3.6.1 단계에서 설명한 방법을 사용하여 GC-MS를 사용하여 샘플을 분석합니다. 원하는 대사 산물의 존재에 대한 GC-MS를 통해 분석 한 후, 풀 잎 추출물을 함께 풀화하고 회전 증발, 실리카 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC를 통해 섹션 3.2 및 3.3에 기재된 바와 같이 순수한 화합물을 얻었다.