Модуляция субклеточной локализации Тау как инструмент для исследования экспрессии генов, связанных с болезнями
Summary
Тау является нейрональным белком, присутствующим как в цитоплазме, где он связывает микротрубочки, так и в ядре, где он оказывает нетрадиционные функции, включая модуляцию генов, связанных с болезнью Альцгеймера. Здесь мы описываем метод исследования функции ядерного Тау, исключая при этом любые помехи, исходящие от цитоплазмии Тау.
Abstract
Тау является микротрубочным связывающим белком, выраженным в нейронах, и его основная известная функция связана с поддержанием цитоскелетной стабильности. Тем не менее, последние данные показали, что Тау присутствует также в других субклеточных отсеках, включая ядро, где он вовлечен в защиту ДНК, в транскрипции RRNA, в мобильности ретротранспозонов и в структурной организации ядро. Недавно мы показали, что ядерный Тау участвует в экспрессии гена VGluT1, предлагая молекулярный механизм, который мог бы объяснить патологическое увеличение высвобождения глутамата на ранних стадиях болезни Альцгеймера. До недавнего времени участие ядерного Тау в модуляции экспрессии генов-мишеней было относительно неопределенным и неоднозначным из-за технических ограничений, которые препятствовали исключению вклада цитоплазмии Тау или эффекта других ниже по течению факторов, не связанных с ядерной Тау. Чтобы преодолеть эту неопределенность, мы разработали метод для изучения экспрессии генов-мишеней, специально модулируемых ядерным белком Тау. Мы использовали протокол, который соединяет использование сигналов локализации и субклеточной фракционирования, что позволяет исключить помехи из цитоплазмических молекул Тау. В частности, протокол прост и состоит из классических и надежных методов, которые в широком смысле применимы для изучения ядерной функции Тау в других типах клеток и клеточных условиях.
Introduction
Функции тау белка в ядре получили значительный интерес в последние годы, как было показано, тесно связаны с нуклеиновыми кислотами1,2,3,4,5,6. Действительно, недавнее исследование генома показало, что Тау связывает генные и межгенные последовательности ДНК in vivo7. Роль в нуклеолярной организации было предложено8,9,10,11. Кроме того, Тау было предложено принять участие в защите ДНК от окислительного и гипертермического стресса5,10,12,13, в то время как мутировавший Тау был связан с хромосомой нестабильности и анеуплоидии14,15,16.
До сих пор проблемы в изучении функций Тау в ядерном отсеке оставались практически нерешенными из-за трудностей в расчленении конкретного вклада ядерного Тау из вклада цитоплазмита Тау. Более того, функции, приписываемые молекулам Тау в ядерном отсеке, до сих пор лишь коррелируют, поскольку в них отсутствует недвусмысленная демонстрация прямого участия ядерных белков Тау. Действительно, участие Тау в мобильности ретротранспозонов или в транскрипции RRNA или в защите ДНК11,12,17,19,19 может быть также объяснено вкладциоплазмическим Тау или влияние других факторов вниз по течению, не связанных с ядерным Тау.
Здесь мы предоставляем метод, который может решить эту проблему, используя классическую процедуру для изоляции ядерного отсека в сочетании с использованием Tau конструкций 0N4R помечены ядерной локализации (NLS) или ядерных экспортных сигналов (NES). Такой подход устраняет сложные вопросы, связанные с возможными артефактами из-за распространения молекул Тау из цитоплазмического отсека. Кроме того, конструкции Тау-НЛС и Тау-НЕС вызывают обогащение или исключение молекул Тау из ядерного отсека, соответственно, обеспечивая положительный и отрицательный контроль за вовлечением ядерных молекул Тау в конкретную функцию. Протокол технически прост, и он состоит из классических и надежных методов, которые широко применимы для изучения ядерной функции Тау в других типах клеток, дифференцированных или нет, таких как раковые клетки, которые активируют Тау выражение20,21. Кроме того, он может быть применен и к другим белкам, которые присутствуют как в цитоплазме, так и в ядре для того, чтобы вскрыть биологические функции, связанные с различными отсеками.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем метод измерения влияния ядерного белка Тау на экспрессию генов. С этим протоколом вклад цитоплазмикТа Тау сильно ограничен. Критические шаги этого протокола следующие: дифференциация клеток SH-SY5Y человека, субклеточная фракционирование и локализация белка Тау в ядерном о?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
Referências
- Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
- Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
- Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically – The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
- Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
- Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
- Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Bioquímica. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
- Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
- Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
- Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
- Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
- Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
- Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
- Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer’s Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
- Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
- Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
- Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
- Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
- Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
- Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
- Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
- Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
- Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
- Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
- Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
- Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
- Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
- ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , (2012).
- Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
- Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?. Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
- Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
- Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
- Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).
