使用流感抗原微阵列测量病毒亚型血清抗体的广度

所有人类血清都按照经批准的生物安全机构协议处理和处置,并使用保护性个人设备。所有参与此协议的实验室人员都接受过生物安全和研究伦理方面的培训。 1. 生产流感抗原微阵列 设计和获取微阵列抗原集 获得表达和纯化的蛋白质抗原作为冻干粉。 将抗原打印到微阵列幻灯片上 将每个冻干抗原重组至磷酸盐缓冲盐水(PBS)中浓度为0.1mg/mL,浓度为0.001%补间-20(T-PBS)。将每个重组抗原的10μL转移到未经处理的384孔平底板的单个孔中。 使用微阵列打印机打印抗原(本研究中使用的微阵列打印机不再具有商业版本,参见讨论),使用低容量微阵列点针将抗原吸入样品通道,并通过直接沉积接触和毛细管作用到16垫硝基纤维素涂层玻璃玻片上。 使用源印版配置和打印参数对打印软件(例如 Gridder)进行编程。 使用下拉菜单选择将使用此打印方法使用的印版类型的名称。对于本研究,使用未经处理的384孔平底板。 选择”印版数”旁边的文本框,并键入此打印协议中使用的样本板数。对于本研究,使用 1 个板。 选择要与此方法一起使用的引脚配置。对于本研究,请使用 8 针配置。 确保原点偏移是幻灯片原点(在管理部分中校准)与打印图钉将在幻灯片上开始打印的位置之间的距离(在 X 和 Y 方向中)。 使用”阵列设计”选项卡,定义数组的大小和形状(每个子数组的点间距和点数)。在本研究中,使用 8 个引脚以 18×18 格式将 324 个点(直径 180 μm,间距为 300 μm)打印到 16 张幻灯片上。 选择打印引脚拾取和点胶样品的参数。在本研究中,每个引脚吸出 250 nL 的抗原溶液,并将 1 nL 打印到 40 个点(所有 8 个引脚共 20 张幻灯片) 配置引脚清洁协议和印迹协议。在这项研究中,每个引脚打印抗原,浸入无菌ddH2O的声波洗涤容器中,然后吸出下一个抗原。 定义示例块打印到幻灯片上的顺序。阵列软件将构造一个带批过的网格索引(.gal)文件来描述每个微阵列中抗原的排列。注: 顶行用于基准(在成像中使用的所有波长都有荧光,例如,本研究中 Qdot 585 nm 链球蛋白偶联和 Qdot 800 nm 链球蛋白联结的混合),以在成像过程中定向网格。对于长时间印刷,源板中的抗原可以通过上下移液,然后离心,或可以准备和使用新的源板定期重新悬浮。 将未探测的微阵列幻灯片放在防光箱中,并保存在室温干燥器柜中,以便长期存放。注: 此时,协议可能会无限期暂停。 执行质量控制检查(需要聚-异氨酸标签) 如步骤 2.1.1-2.1.2 中所述且如图 2所示,将幻灯片连接到探测室,并用阻塞缓冲液重新冻结。 在过滤的1x阻断缓冲液中稀释小鼠单克隆多-His抗体1:100。注:如果非纯化蛋白抗原(例如,在体外转录和翻译系统中表示)直接用于打印微阵列,则添加蛋白质表达系统的组成部分(例如大肠杆菌解结物),与阻断用于血清稀释的缓冲液,以阻止针对这些成分的任何抗体。 吸入后,将100μL稀释的聚-His抗体加入每个带阵列垫的滑动室,在室温下孵育2小时,或在摇摇器上4°C下孵育2小时。如步骤 2.2.1 所述,使用 T-TBS 缓冲液清洗 3 倍。稀释生物锡结合山羊抗小鼠IgG二级抗体1:200在阻断缓冲液中,吸入后每孔加入100μL,并在振动器室温下孵育1小时。使用 T-TBS 缓冲液清洗 3 倍。 稀释 Qdot 585 nm 链球菌结合到 4 nM 的阻塞缓冲液中,吸入后每孔加入 100 μL,并在振动器室温下孵育 1 小时。使用 T-TBS 缓冲液洗涤 3 倍,然后用 TBS 缓冲器洗涤一次(不带补间)。 如步骤 2.2.5 和 3.1.2 中所述,对幻灯片进行分解和量化。注:蛋白质抗原必须包含他的10个标签才能使用此质量控制协议。或者,如果包含其他标签,可以使用该标签的抗体或配体进行质量控制检查。 2. 使用微阵列的流感抗体探针血清 在微阵列上孵育血清,用于抗体结合 使用剪辑将微阵列幻灯片连接到腔室,并放置在帧中,如图3所示。注意:始终避免用手和仪器触摸微阵列垫。确保幻灯片朝向,垫面朝上,右上角的小切口。 再水化微阵列滑动100μL每孔过滤1x阻塞缓冲液,稀释血清1:100在100μL的阻塞缓冲液(可以使用未经处理的96孔板或2 mL管)。在100-250rpm的轨道摇床室温下,在覆盖框架中孵育再水化微阵列幻灯片,并在室温下分别孵育30分钟。在摇床上类似地执行所有后续孵育步骤。注:Sera 应在-80°C 处进行加注和冷冻,以便长期储存,以尽量减少冻融周期,并在使用前涡旋混合和离心以去除颗粒。在此步骤期间和之后仔细观察滑动室,以检测任何需要重新装配滑动室的泄漏。 使用连接到带有二次收集瓶的真空管线的移液器吸头,小心地从每个腔室的角落吸气缓冲缓冲器,无需接触焊盘。以类似方式执行所有后续的吸入步骤。吸入后快速将稀释的血清添加到垫子中,以免垫子干燥。 将盖框架放在被湿纸巾包围的辅助容器内的托盘中,并密封以防止蒸发。在摇摇器上以4°C孵育过夜(或者,在100-250rpm的轨道摇床室温下孵育2小时)。 标记结合血清抗体与量子点结合的二级抗体 如上文所述,从腔室中小心吸气,每井加入100 μL T-TBS缓冲液(20mM Tris-HCl,150 mM NaCl,ddH2O 中的0.05%补间-20,调整至pH 7.5并过滤,可进行商业处理),并在轨道摇摇器上孵育5分钟,100-250 rpm。重复此洗涤步骤共 3 倍(所有后续洗涤步骤都执行类似)。 将二级抗体的混合物稀释至1 μM,以阻断缓冲液,并在使用前和使用期间通过移液彻底混合,以保持均匀性。注:为了保持测定的可重复性,应使用同一批次的每个二级抗体进行所有探测实验,并计划对实验数据进行定量比较。二次抗体的具体浓度可能需要根据亲和力而变化;随时随制造商的协议。 最终洗涤后从腔室吸气缓冲液,每井加入100μL的二次抗体混合物,并在振动器室温下孵育2小时。 吸气二级抗体混合物用T-TBS缓冲液洗涤3x,然后用TBS缓冲液洗涤一次(无补间)。 从腔室中小心地滑动微阵列,以避免接触垫,用过滤过的 ddH2O 轻轻冲洗,然后放入 50 mL 管中并离心 500 x g 10 分钟。请小心冲洗。 将探头微阵列幻灯片放在防光箱中,并保存在室温干燥器柜中,以便长期存放。注: 此时,协议可能会暂停长达 1 周。 3. 定量与微阵列内抗原结合的抗体 可视化微阵列幻灯片并量化点荧光强度,以测量抗体结合 使用带有内置软件的便携式成像器获取微阵列幻灯片的图像。 在”配置映像器”选项卡中,选择正确的幻灯片配置。对于本研究,请使用 16 张幻灯片。 在”图像控制”选项卡中,选择正确的荧光通道,并根据血清的反应性调整增益、曝光时间和采集时间,以获得最佳图像。本研究的IgA和IgG的荧光通道分别为585nm和800nm,成像设置增益为50,暴露时间为500ms,采集时间为1s。 单击”捕获”可开始获取图像的过程。注:微阵列幻灯片可以在多个设置下重新成像,只要它们存储在黑暗和干燥,信号不会降低。如果与幻灯片兼容,可以使用其他成像系统。 使用基于基准标记的网格检测阵列点,并将点强度作为像素强度的中位数减去围绕点测量的背景。使用内置成像器软件批量执行此量化算法,该软件利用步骤 1.2.2 中构造的 .gal 文件将点强度连接到每个微阵列上的单个抗原。 在”文件信息”面板中,通过从计算机上的文件夹选择上载 .gal 文件,并在”分析选项”部分中指定要保存分析输出文件的文件夹。 在”图像控制”选项卡中,打开要量化的获取图像之一,然后选择右上角的”自动”按钮。 在右下角的”阵列分析”部分中,按照软件的说明创建基准模板。 单击”批处理分析”,选择包含要量化的图像的文件夹,然后选择在上一步中创建基准模板。该软件分析每个图像并量化点强度。注:此步骤将生成一个 .csv 文件,其中包含每个血清样本中定量的抗体的点强度,这些抗体与微阵列上的每个单个抗原结合,随后可在电子表格操作或分析软件中操作。 分析原始数据,比较抗原和血清标本的抗体结合。在这项研究中,IgA和IgG抗体测量为585nm和800nm荧光点强度,在实验的2个独立运行之间,使用不同日期的不同幻灯片对所有抗原进行了比较,并进行了相关分析,测量测定可重复性。注:对于作为表达混合物打印的非纯化蛋白质,数据分析应从无DNA对照的背景减法开始。