Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama
Summary
Sıralama (RH-seq) ile karşılıklı hemizygosity türler arasındaki bir özellik farkıgenetik temelharita için güçlü bir yeni yöntemdir. Hemizygot havuzları transposon mutagenezi tarafından oluşturulur ve fitness yüksek sıralama boyunca kullanarak rekabetçi büyüme ile izlenir. Elde edilen verilerin analizi, özelliğin altında yatan genleri saptar.
Abstract
Modern genetiğin temel amacı, vahşi doğadaki organizmaların fenotipte nasıl ve neden farklılık gösterebildiğini anlamaktır. Bugüne kadar, alan büyük ölçüde bağlantı ve ilişki haritalama yöntemleri, DNA dizi varyantları ve fenotip arasında bir türün bireyler ilerler arasındaki miyetler arasında arasındaki ilişkiyi iz gelişmiştir. Bu yaklaşımlar, güçlü olmasına rağmen, üreme tarafından izole edilmiş türler arasındaki özellik farklılıklarına pek uygun değildir. Burada, uyumsuz türlere kolayca uygulanabilen doğal özellik varyasyonunun genom çapında diseksiyonu için yeni bir yöntem tanımlıyoruz. Stratejimiz RH-seq, karşılıklı hemizygot testinin genom çapında uygulanmasıdır. Biz maya Saccharomyces cerevisiae kardeş türü S. paradoxusgöre çarpıcı yüksek sıcaklık büyüme sorumlu genleri tanımlamak için koşum . RH-seq transposon mutagenez kullanır karşılıklı hemizygotbir havuz oluşturmak için, daha sonra yüksek-throughput sıralama yoluyla yüksek sıcaklık rekabet yoluyla izlenir. Burada ortaya konan RH-seq iş akışımız, genetik haritalama için genomik kapsama alanı sağlamak için kaynak yoğun derin sıralamanın gerekli olduğu ihtarına bağlı olarak, tomurcuklanan maya clade’daki antik ve karmaşık özellikleri incelemek için titiz ve tarafsız bir yol sağlar. Sıralama maliyetleri düştükçe, bu yaklaşım ökaryotlar arasında gelecekteki kullanım için büyük bir umut vaat ediyor.
Introduction
Alanın başlangıcından bu yana, vahşi bireyler arasında varyasyon mekanistik temelini anlamak için genetik bir ana hedef olmuştur. Biz ilgi bir özellik altında yatan loci harita olarak, ortaya çıkan genler tanı ve ilaçlar için hedef olarak hemen kullanılabilir, ve evrim ilkelerine ışık tutabilir. Bu amaçla doğru endüstri standardı bağlantı veya dernek1üzerinden bir popülasyon arasında genotip ve fenotip arasındaki ilişkiyi test etmektir. Bu yaklaşımlar ne kadar güçlü sayılsa da, bir anahtar sınırlaması vardır— interfertile bireyler arasındaki haçlardan gelen büyük rekombinant soyundan gelen panellere güvenirler. Onlar ilk etapta döl oluşturmak için çiftleşemez türlerin çalışmada hiçbir faydası yoktur. Bu nedenle, alan üreme izole türler arasındaki özellik farklılıkları nın tarafsız diseksiyon için çok az kapasiteye sahip olmuştur2.
Bu çalışmada, türler arasındaki özellik değişiminin genetik temelinin genomölçeğinde incelenmesi için yeni bir yöntem olan RH-seq 3’ün teknik temellerini rapor ediyoruz. Bu yaklaşım karşılıklı hemizygot testi bir kitlesel paralel versiyonu4,5, ilk bir iki genetik olarak farklı arka planlar arasındaki allelik farklılıkların henotilik etkilerini değerlendirmek için bir yol olarak tasarlandı özel lokus (Şekil 1A). Bu şemada, iki farklı birey bir melez oluşturmak için ilk çiftleşirler, genomun yarısı ilgili ebeveynlerin her birinden gelir. Bu arka planda, her biri her bir ebeveynin lokus alelinin kesintiye uğramış veya silinmiş bir kopyasını içeren birden çok suş oluşturulur. Bu suşlar, genomun her yerinde diploid olarak kaldıkları için hemizygousdur, haploid olarak kabul edilirler ve her birinin sadece bir ebeveynin alelinden yoksun olduğu için karşılıklı olarak adlandırılırlar. diğer ebeveyn. Bu karşılıklı hemizygot suşlarının fenotiplerini karşılaştırarak, manipüle edilmiş çekirgedeki DNA dizivaryantlarının ilgi özelliğine katkıda bulunup bulunmadığı sonucuna varılabilir, çünkü çekirgedeki varyantlar karşılıklı lık arasındaki tek genetik farktır. hemizygot suşları. Bu şekilde, iyi kontrol edilen deneysel bir kurulumda türler arasındaki genetik farklılıkları, aralarındaki henotipik farka bağlamak mümkündür. Bugüne kadar bu testin uygulamaları bir aday-gen çerçevesinde olmuştur-yani hipotez zaten bir aday locus doğal varyasyon bir özellik etkileyebilecek elinde olduğu durumlarda.
Aşağıdaki ler de, mayayı model sistem olarak kullanarak genom ölçeğinde karşılıklı hemizygosity ekran protokolünü ortaya koyuyoruz. Yöntemimiz, türler arasında canlı, steril F1 melezleri üreterek ve transpozon mutagenezine maruz bırakarak hemizygot mutantlarının genomik bir tamamlayıcısını oluşturur. Hemizygotları bir araya, sıralamaya dayalı tahlillerde fenomenotipleri ölçer ve belirli bir genin iki ebeveyninin alellerini taşıyan havuzun klonları arasındaki frekans farklılıklarını test ediyoruz. Sonuç, türler arasındaki varyantların ilgi çekiciliğini etkilediği loci kataloğudur. Biz iki tomurcuklanan maya türleri arasındaki termotolerans farklılıklarıgenetik temelini açıklamak için RH-seq iş akışı uygulamak, Saccharomyces cerevisiae ve S. paradoksus, hangi ~ 5 milyon yılönce6 farklı .
Protocol
Representative Results
Discussion
RH-seq’nin önceki istatistiksel-genetik yöntemlere göre avantajları birkaç kat daha fazladır. Bağlantı ve ilişkilendirme analizinin aksine, RH-seq tek gen haritalama çözünürlüğü sağlar; bu nedenle, belirli bir türün bireyler iã§inde özellik deÄ iÅ imi ã§alıŠmalarının yanı sıra ara sırada farklı olma olasılÄ±Ä Ä±nın artırılmıŠolması bÃ1/4yÃ1/4k olasılıkla çne sÃ1/4r Ayrıca, genom çapında karşılıklı hemizygosity analizi önceki girişi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Roop, R. Hackley, I. Grigoriev, A. Arkin ve J. Skerker’e orijinal çalışmaya katkılarından dolayı teşekkür ederiz, F. AlZaben, A. Flury, G. Geiselman, J. Hong, J. Kim, M. Maurer ve L. Oltrogge teknik yardım için, D. Savage mikroskoposkopi ile cömertliği için kaynaklar ve B. Blackman, S. Coradetti, A. Flamholz, V. Guacci, D. Koshland, C. Nelson ve A. Sasikumar; Biz de J. Dueber (Biyomühendislik Bölümü, UC Berkeley) PiggyBac plazmid için teşekkür ederiz. Bu çalışma R01 GM120430-A1 ve Abd Enerji Bölümü Ortak Genom Enstitüsü, Bir DOE Ofis Bilim Kullanıcı Tesisi RBB Için Toplum Sıralama Projesi 1460 tarafından desteklenmiştir. Sonuncusu tarafından yürütülen çalışma Sözleşme No altında ABD Enerji Bakanlığı Bilim Ofisi tarafından desteklenmiştir. DE-AC02-05CH11231.
Materials
| 1-2 plasmid Gigaprep kits | Zymo Research | D4204 | The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA. |
| 10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 1M LiOAc | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 300 mg/mL Geneticin (G418) | Gibco | 11811023 | |
| 52% polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | 1546547 | Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer |
| Autoclaved LB liquid broth | BD Difco | 244620 | Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use. |
| Carbenicillin stock in water (100 mg/mL) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA] | 5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco | 5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919 | |
| DMSO | Any | N/A | |
| E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Illumina Hiseq 2500 | used for SE-150 reads | ||
| Large shaking incubators with variable temperature settings | Any | N/A | |
| LB + carbenicillin agar plates (100 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 μg/mL before drying. |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit Fluorimeter | Thermo Scientific | Q33240 | |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Water bath at 39°C | Any | N/A | |
| Yeast fungal gDNA prep kit | Zymo Research | D6005 | |
| Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media | BD Difco | Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750 | Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving. |
| YPD + G418 agar plates (300 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 μg/mL before drying. |
| YPD agar plates | Agar: BD Difco | Agar: 214010 |
Referências
- Flint, J., Mott, R. Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls. Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).
- Allen Orr, H. The genetics of species differences. Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).
- Weiss, C. V., et al. Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance. Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).
- Stern, D. L. Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test. Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).
- Steinmetz, L. M., et al. Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast. Nature. 416, 326-330 (2002).
- Scannell, D. R., et al. The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus. G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).
- Wetmore, K. M., et al. Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons. MBio. 6, e00306-e00315 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 550 (2014).
- Wilkening, S., et al. An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 196, 853-865 (2014).
- Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae. G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).
