Ömsesidig hemizygosity via sekvensering (RH-SEQ) är en kraftfull ny metod för att kartlägga den genetiska grunden för en drag skillnad mellan arter. Pooler av hemizygotes genereras av transposon mutagenes och deras lämplighet spåras genom konkurrenskraftig tillväxt med hög-hela sekvensering. Analys av resulterande data pekar på gener bakom drag.
Ett centralt mål för modern genetik är att förstå hur och varför organismer i naturen skiljer sig i fenotyp. Hittills har fältet avancerat till stor del på styrkan i kopplingen och Association kartläggnings metoder, som spårar sambandet mellan DNA-sekvens varianter och fenotyp över rekombinant avkomma från parningar mellan individer av en art. Dessa metoder, även om kraftfulla, är inte väl lämpade för drag skillnader mellan reproducerbara isolerade arter. Här beskriver vi en ny metod för genomomfattande dissektion av naturlig drag variation som lätt kan appliceras på oförenliga arter. Vår strategi, RH-SEQ, är ett genombrett genomförande av det ömsesidiga hemizygotetestet. Vi utnyttjade det för att identifiera de gener som ansvarar för den slående hög temperatur tillväxt av jästen Saccharomyces cerevisiae i förhållande till dess syster arter S. paradoxus. RH-SEQ utnyttjar transposon mutagenes att skapa en pool av ömsesidiga hemizygotes, som sedan spåras genom en hög temperatur konkurrens via hög kapacitet sekvensering. Vår RH-SEQ arbetsflöde som anges här ger en rigorös, opartisk sätt att dissekera gamla, komplexa drag i spirande jäst klad, med förbehållet att resurskrävande djupsekvensering behövs för att säkerställa genomisk täckning för genetisk kartläggning. Eftersom sekvenserings kostnaderna sjunker, har denna metod ett stort löfte för framtida användning över eukaryotes.
Sedan gryningen av fältet, har det varit ett huvudmål i genetik att förstå mekanistiska grunden för variation över vilda individer. När vi karta loci underliggande ett drag av intresse, kan de framväxande gener vara till omedelbar användning som mål för diagnostik och droger, och kan belysa principerna om evolution. Branschstandarden för detta ändamål är att testa för ett förhållande mellan genotyp och fenotyp över en population via länkning eller Association1. Kraftfull eftersom dessa metoder är, de har en nyckel begränsning-de förlitar sig på stora paneler av rekombinant avkomma från korsningar mellan interfertil individer. De är inte till någon nytta i studiet av arter som inte kan para sig för att bilda avkomman i första hand. Som sådan har fältet haft liten kapacitet för opartisk dissektion av drag skillnader mellan reproducerbara isolerade arter2.
I detta arbete rapporterar vi den tekniska underbyggnaden av en ny metod, RH-SEQ3, för genomskalningsundersökningar av den genetiska grunden för karaktärsvariationen mellan arter. Detta tillvägagångssätt är en massivt parallell version av det ömsesidiga hemizygotetestet4,5, somförst utformades som ett sätt att utvärdera fenotypiska effekter av alleliska skillnader mellan två genetiskt distinkta bakgrunder på en särskilda Locus (figur 1a). I detta system, de två skilda individer är först parat att bilda en hybrid, hälften av vars arvsmassa kommer från var och en av de respektive föräldrarna. I den här bakgrunden genereras flera stammar, som var och en innehåller en avbruten eller borttagen kopia av varje förälders allel av Locus. Dessa stammar är hemizygot eftersom de förblir diploida överallt i arvsmassan utom vid Locus av intresse, där de anses vara haploid, och kallas ömsesidiga eftersom var och en saknar endast en förälders allel, med dess återstående allel härrör från andra föräldern. Genom att jämföra fenotyper av dessa ömsesidiga hemizygote stammar, kan man dra slutsatsen om DNA-sekvens varianter på manipulerade Locus bidra till drag av intresse, eftersom varianter på Locus är den enda genetiska skillnaden mellan den ömsesidiga hemizygote stammar. På detta sätt är det möjligt att länka genetiska skillnader mellan arter till en fenotypisk skillnad mellan dem i en välkontrollerad experimentell inställning. Hittills har ansökningarna av detta test varit i en kandidat-gen ram-det vill, fall där hypotesen redan är i handen att naturliga variation på en kandidat Locus kan påverka ett drag.
I det följande, vi lägger ut protokollet för en genomskala ömsesidig hemizygosity skärm, med hjälp av jäst som modellsystem. Vår metod skapar ett genomiskt komplement av hemizygote mutanter, genom att generera livskraftiga, sterila F1 hybrider mellan arter och utsätta dem för transposon mutagenes. Vi poolar hemizygoterna, mäta deras fenotyper i sekvenserings-baserade analyser, och testa för skillnader i frekvens mellan kloner av poolen som bär de två föräldrarnas alleler av en given gen. Resultatet är en katalog av loci där varianter mellan arter påverka karaktärsdrag av intresse. Vi genomför RH-SEQ arbetsflöde för att belysa den genetiska grunden för termotolerans skillnader mellan två spirande jäst arter, Saccharomyces cerevisiae och S. paradoxus, som divergerat ~ 5 000 000 år sedan6.
Fördelarna med RH-SEQ jämfört med tidigare statistiska genetiska metoder är flera gånger. Till skillnad från kopplings-och associationsanalys ger RH-SEQ en lösning för enkel gen mappning. som sådan, det kommer sannolikt att vara av betydande nytta även i studier av drag variation mellan individer av en viss art, samt mellanartskonkurrens skillnader. Även tidigare försök till genomomfattande ömsesidig hemizygosity analys används samlingar av gendeletion mutanter, varav några Harbor sekundära mutationer so…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar J. Roop, R. Hackley, I. Grigoriev, A. Arkin och J. skerker för deras bidrag till den ursprungliga studien, F. alzaben, A. FLURY, G. geiselman, j. Hong, j. Kim, M. Maurer och L. oltrogge för tekniskt bistånd, D. Savage för hans generositet med mikroskopi och B. Blackman, S. Coradetti, A. Flamholz, V. Guacci, D. Koshland, C. Nelson och A. Sasikumar för diskussioner. Vi tackar också J. Dueber (Institutionen för bioteknik, UC Berkeley) för PiggyBac plasmid. Detta arbete stöddes av R01 GM120430-a1 och av community sekvensering projekt 1460 till RBB vid US Department of energi joint Genome Institute, en DOE Office of Science User Facility. Det arbete som utfördes av den senare stöddes av Office of Science i USA: s energidepartement enligt kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231.
1-2 plasmid Gigaprep kits | Zymo Research | D4204 | The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA. |
10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
1M LiOAc | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
300 mg/mL Geneticin (G418) | Gibco | 11811023 | |
52% polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | 1546547 | Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer |
Autoclaved LB liquid broth | BD Difco | 244620 | Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use. |
Carbenicillin stock in water (100 mg/mL) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA] | 5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco | 5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919 | |
DMSO | Any | N/A | |
E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
Illumina Hiseq 2500 | used for SE-150 reads | ||
Large shaking incubators with variable temperature settings | Any | N/A | |
LB + carbenicillin agar plates (100 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 μg/mL before drying. |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
Qubit Fluorimeter | Thermo Scientific | Q33240 | |
Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
Water bath at 39°C | Any | N/A | |
Yeast fungal gDNA prep kit | Zymo Research | D6005 | |
Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media | BD Difco | Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750 | Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving. |
YPD + G418 agar plates (300 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 μg/mL before drying. |
YPD agar plates | Agar: BD Difco | Agar: 214010 |