Генетическое картирование различий термотерпимости между видами дрожжей Сахаромицес с помощью геномно-широкого взаимного анализа гемизигоси
Summary
Взаимная гемизигоity через секвенирование (RH-seq) является мощным новым методом для картирования генетической основы черта разница между видами. Бассейны гемизиготов генерируются транспозонным мутагенезом, и их пригодность отслеживается за счет конкурентного роста с использованием высокой последовательности. Анализ полученных данных выявляет гены, лежащие в основе этой черты.
Abstract
Главная цель современной генетики – понять, как и почему организмы в дикой природе отличаются фенотипом. На сегодняшний день, поле продвинулось в основном на прочность связи и ассоциации картирования методов, которые прослеживают связь между вариантами последовательности ДНК и фенотипа через рекомбинантные потомство от спаривания между отдельными лицами вида. Эти подходы, хотя и мощные, не очень хорошо подходят для различия между репродуктивно изолированных видов. Здесь мы описываем новый метод для рассеивания генома в ширину естественной вариации черт, которые могут быть легко применены к несовместимым видам. Наша стратегия, RH-seq, является реализацией взаимного теста гемизигот. Мы использовали его для выявления генов, ответственных за поразительный высокий рост температуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae по отношению к его сестра видов S. paradoxus. RH-seq использует транспозонный мутагенез для создания пула взаимных гемизиготов, которые затем отслеживаются через высокотемпературную конкуренцию с помощью высокой пропускной способности секвенирования. Наш RH-seq рабочий процесс, как изложены здесь обеспечивает строгий, беспристрастный способ вскрыть древние, сложные черты в подающий надежды дрожжевой кладе, с оговоркой, что ресурсоемкие глубокого секвенирования необходимо для обеспечения геномного покрытия для генетического картирования. По мере снижения затрат на секвенирование этот подход открывает большие перспективы для использования в будущем в эукариотах.
Introduction
С самого начала поля, она была главной целью в генетике, чтобы понять механистическую основу вариации между дикими особями. По мере того как мы сопозываем локусы, лежащие в основе интересующей черты, возникающие гены могут быть немедленно использоваться в качестве мишеней для диагностики и лекарств, и могут пролить свет на принципы эволюции. Отраслевой стандарт в этом направлении заключается в том, чтобы проверить связь между генотипом и фенотипом среди населения через связь или ассоциации1. Мощные, как эти подходы, они имеют одно ключевое ограничение- они полагаются на большие панели рекомбинантных потомство от крестов между межплодными лицами. Они не имеют смысла в изучении видов, которые не могут спариваться, чтобы сформировать потомство в первую очередь. Таким образом, поле было мало возможностей для беспристрастного вскрытия черт различия между репродуктивно изолированных видов2.
В этой работе мы сообщаем о технических основах нового метода, RH-seq3, для генома масштаба обследований генетической основы вариации черты между видами. Этот подход является массово параллельной версией взаимного теста гемизиготе4,5, который был впервые задуман как способ оценки фенотипических эффектов аллельных различий между двумя генетически различными фонами на частности, локус(рисунок 1A). В этой схеме, два расходящихся лиц сначала спариваются, чтобы сформировать гибрид, половина которого генома исходит от каждого из соответствующих родителей. На этом фоне генерируются несколько штаммов, каждый из которых содержит прерванную или удаленную копию аллеля локуса каждого родителя. Эти штаммы являются hemizygous, поскольку они остаются diploid везде в геноме, за исключением локуса интересов, где они считаются гаплоидными, и называются взаимными, поскольку каждый не хватает только аллеля одного родителя, с его оставшимся аллелем, полученным из другого родителя. Сравнивая фенотипы этих взаимных штаммов гемизигот, можно сделать вывод, способствуют ли варианты последовательности ДНК в манипулируемом локусе черту интереса, так как варианты в локусе являются единственной генетической разницей между взаимными гемизигот штаммов. Таким образом, можно связать генетические различия между видами с фенотипической разницы между ними в хорошо контролируемой экспериментальной установки. На сегодняшний день применение этого теста было в рамках кандидата-гена, то есть, случаи, в которых гипотеза уже в руках, что естественные изменения в кандидат локус может повлиять на черту.
В следующем, мы выкладываем протокол для генома масштаба взаимной гемизигосности экрана, используя дрожжи в качестве модели системы. Наш метод создает геномное дополнение мутантов гемизигота, генерируя жизнеспособные, стерильные гибриды F1 между видами и подвергая их транспозонному мутагенезу. Мы объединяем гемизиготы, измеряем их фенотипы в анализах на основе секвенирования и проверяем различия в частоте между клонами бассейна, несущими аллели двух родителей данного гена. Результатом является каталог локусов, на которых варианты между видами влияют на черту интереса. Мы реализуем rh-seq рабочий процесс, чтобы выяснить генетическую основу термопереносимости различия между двумя начинающими видами дрожжей, Saccharomyces cerevisiae и S. paradoxus, которые разошлись 5 миллионов лет назад6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Преимущества RH-seq по сравнению с предыдущими статистически-генетическими методами в несколько раз. В отличие от анализа связей и ассоциаций RH-seq обеспечивает разрешение картирования с одним геном; как таковой, он, вероятно, будет значительным полезным даже в исследованиях изменения чер…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Д. Роопа, Р. Хэкли, И. Григорьева, А. Аркина и Д. Скеркера за их вклад в первоначальное исследование, Ф. Альшабена, А. Флюри, Г. Гайзельмана, Д. Хонга, Д. Кима, М. Маурера и Л. Олтрогге за техническую помощь, Д. Сэвиджа за его щедрость с микроскопией ресурсов, а Б. Блэкман, С. Корадетти, А. Фламхольц, В. Гуаччи, Д. Кошланд, К. Нельсон и А. Сасикумар для обсуждения; мы также благодарим J. Dueber (Департамент биоинженерии, Калифорнийский университет в Беркли) за космид PiggyBac. Эта работа была поддержана R01 GM120430-A1 и сообществом секвенирования проекта 1460 в RBB в Министерстве энергетики США Совместный институт генома, Министерство энергетики США Управления науки пользователей фонда. Работа, проведенная последним, была поддержана Управлением по науке Министерства энергетики США по контракту No. DE-AC02-05CH11231.
Materials
| 1-2 plasmid Gigaprep kits | Zymo Research | D4204 | The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA. |
| 10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 1M LiOAc | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| 300 mg/mL Geneticin (G418) | Gibco | 11811023 | |
| 52% polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | 1546547 | Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer |
| Autoclaved LB liquid broth | BD Difco | 244620 | Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use. |
| Carbenicillin stock in water (100 mg/mL) | Any | N/A | Filter sterilize through a 0.22 μm filter before use. |
| Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA] | 5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco | 5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919 | |
| DMSO | Any | N/A | |
| E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-) | N/A | N/A | Request from Brem lab. |
| Illumina Hiseq 2500 | used for SE-150 reads | ||
| Large shaking incubators with variable temperature settings | Any | N/A | |
| LB + carbenicillin agar plates (100 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 μg/mL before drying. |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit Fluorimeter | Thermo Scientific | Q33240 | |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Water bath at 39°C | Any | N/A | |
| Yeast fungal gDNA prep kit | Zymo Research | D6005 | |
| Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media | BD Difco | Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750 | Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving. |
| YPD + G418 agar plates (300 μg/mL) | Agar: BD Difco | Agar: 214010 | Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 μg/mL before drying. |
| YPD agar plates | Agar: BD Difco | Agar: 214010 |
Referências
- Flint, J., Mott, R. Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls. Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).
- Allen Orr, H. The genetics of species differences. Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).
- Weiss, C. V., et al. Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance. Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).
- Stern, D. L. Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test. Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).
- Steinmetz, L. M., et al. Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast. Nature. 416, 326-330 (2002).
- Scannell, D. R., et al. The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus. G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).
- Wetmore, K. M., et al. Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons. MBio. 6, e00306-e00315 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 550 (2014).
- Wilkening, S., et al. An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 196, 853-865 (2014).
- Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae. G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).
